寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊在2018年10月26日發(fā)表于Signal Transduct Target Ther（IF：9.683，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊是Yingli Wu教授，研究表明USP7是一種穩(wěn)定NOTCH1的新型去泛素酶，并且可能是T-ALL的治療靶點(diǎn)。

研究背景

????????T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)具有高度侵襲性，主要由NOTCH1信號通路的異常激活引起。NOTCH1是一種跨膜蛋白，其被激活后會釋放NOTCH1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICN1)。作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，NOTCH1調(diào)節(jié)多種細(xì)胞事件，包括細(xì)胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移和分化。

????????先前研究表明，泛素化調(diào)控NOTCH1的穩(wěn)定性、活性和定位。eIF3f已被報道作為一種去泛素酶調(diào)節(jié)NOTCH1的激活，但調(diào)節(jié)NOTCH1蛋白穩(wěn)定性的去泛素酶尚不清楚。USP7通過其去泛素化活性可以影響底物的定位、活化和穩(wěn)定性。在肝細(xì)胞癌、乳腺癌和卵巢癌等多種癌癥中均檢測到USP7的過表達(dá)，抑制USP7可以抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。

摘要部分

????????在這里，作者報道了泛素特異性蛋白酶7(USP7)通過去泛素化作用維持NOTCH1穩(wěn)定。在T-ALL細(xì)胞中，USP7與NOTCH1相互作用。在體內(nèi)外，USP7的缺失顯著抑制T-ALL細(xì)胞的增殖，并伴隨著NOTCH1蛋白水平的下調(diào)。同樣，藥物抑制USP7可導(dǎo)致T-ALL細(xì)胞凋亡。作者還發(fā)現(xiàn)USP7在人類T-ALL細(xì)胞系和患者樣本中顯著上調(diào)，并且一種USP7抑制劑對原代T-ALL細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性?？傮w而言，作者的研究表明USP7是一種穩(wěn)定NOTCH1的新型去泛素酶，它可能是T-ALL的一個治療靶點(diǎn)。

研究內(nèi)容

1.USP7維持ICN1穩(wěn)定? ? ?

????????作者在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)22個USPs并分析內(nèi)源性ICN1的蛋白水平。篩查顯示，USP7顯著上調(diào)了ICN1的蛋白水平。此外，催化失活的USP7突變體(USP7C223S)無法上調(diào)ICN1，表明USP7對ICN1的調(diào)節(jié)依賴于其DUB活性。

????????接著作者發(fā)現(xiàn)，P22077（USP7抑制劑）處理T-ALL細(xì)胞系(JURKAT、MOLT-4等)后，ICN1蛋白水平呈劑量依賴性降低，但未改變其mRNA水平。另一方面，蛋白酶體抑制劑MG132阻斷了P22077誘導(dǎo)的ICN1下調(diào)。

研究結(jié)論：去泛素酶USP7控制NOTCH1蛋白的穩(wěn)定性。

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2.USP7與ICN1相互作用??? ?

????????作者通過免疫沉淀探究USP7是否與ICN1相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的Myc-ICN1與FLAG-USP7相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明USP7與ICN1之間存在直接相互作用。此外，免疫熒光表明USP7和NOTCH1共定位于細(xì)胞核。

????????實(shí)驗(yàn)表明，USP7通過其N端MATH結(jié)構(gòu)域和C端UBL結(jié)構(gòu)域與ICN1相互作用。其中，UBL結(jié)構(gòu)域足以與ICN1結(jié)合，然而USP7的催化結(jié)構(gòu)域本身不能與ICN1結(jié)合。

研究結(jié)論：USP7在體內(nèi)外都與ICN1相互作用，并且USP7的MATH結(jié)構(gòu)域和UBL結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了這種相互作用。

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3.USP7去泛素化ICN1? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)ICN1與野生型USP7的共表達(dá)降低了泛素化ICN1的蛋白水平。同樣，P22077對USP7的抑制完全阻斷了USP7對ICN1的去泛素化。值得注意的是，缺少M(fèi)ATH或UBL結(jié)構(gòu)域的USP7突變體無法從ICN1中移除泛素。

????????作者將HA-泛素和Myc-ICN1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)USP7后泛素化ICN1的蛋白水平增加。另外，體外去泛素化實(shí)驗(yàn)顯示，純化的USP7顯著降低了ICN1的泛素化水平。

研究結(jié)論：ICN1是去泛素酶USP7的直接底物，USP7介導(dǎo)ICN1的去泛素化。

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4.USP7在T-ALL中過表達(dá)

????????作者分析了USP7在一系列人類癌細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)現(xiàn)USP7在T-ALL中高表達(dá)。有趣的是，NOTCH1突變型T-ALL患者的USP7表達(dá)水平明顯高于NOTCH1野生型患者。此外，USP7在人類T-ALL細(xì)胞系和原發(fā)T-ALL患者中均高度表達(dá)。

研究結(jié)論：USP7在人類T-ALL中的表達(dá)水平更高。

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5.下調(diào)USP7可降低ICN1蛋白水平并抑制體內(nèi)外T-ALL細(xì)胞增殖??? ?

????????實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)USP7顯著降低了JURKAT和MOLT-4細(xì)胞中的內(nèi)源性ICN1蛋白水平。WB表明，USP7的耗盡與ICN1半衰期的減少有關(guān)。此外，USP7的敲低顯著抑制了JURKAT和MOLT-4細(xì)胞的增殖。

????????作者將JURKAT細(xì)胞靜脈注射到NSG小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。移植23天后對照組出現(xiàn)典型的白血病并開始死亡。而USP7缺乏組的脾臟比對照組的小得多，且其脾內(nèi)淋巴白血病細(xì)胞浸潤較少。此外，很多USP7缺失的小鼠中檢測到的白血病細(xì)胞較少。

研究結(jié)論：USP7作為NOTCH1的上游調(diào)控因子，其在調(diào)節(jié)T-ALL的增殖中具有重要作用。

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6.USP7的藥理抑制誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞凋亡

????????作者接下來評估了USP7抑制劑P22077對四個T-ALL細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示P22077以劑量依賴的方式降低細(xì)胞存活率。更重要的是，P22077對原代T-ALL細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。利用Annexin V/PI雙染試驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)P22077顯著誘導(dǎo)CCRF-CEM和CUTLL1的細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)論：USP7抑制劑P22077對T-ALL細(xì)胞株和患者T-ALL細(xì)胞具有毒性作用。

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結(jié)論與討論

????????本研究中,作者證實(shí)了USP7是一種新的NOTCH1去泛素酶,它能逆轉(zhuǎn)NOTCH1多泛素化并維持NOTCH1蛋白穩(wěn)定。在體內(nèi)外，抑制USP7可導(dǎo)致NOTCH1降解并抑制T-ALL細(xì)胞增殖。作者的發(fā)現(xiàn)提供了一種終止NOTCH1信號的新途徑，表明以USP7/NOTCH1信號軸為靶點(diǎn)是對抗T-ALL和其他NOTCH1相關(guān)惡性腫瘤的一種新策略。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41392-018-0028-3