鼻咽癌（NPC）具有獨(dú)特的地理分布的惡性腫瘤，多發(fā)于我國(guó)華南地區(qū)[1]。由于鼻咽癌的早期癥狀不明顯或不明確，早期診斷率較低且易于轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的放化聯(lián)合治療效果不佳是鼻咽癌治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，深入了解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，明確早期診斷生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)已成為該領(lǐng)域迫切的科學(xué)挑戰(zhàn)。

環(huán)狀RNA（circRNAs）是一類新的非編碼RNA，由于具有高穩(wěn)定性等特殊的分子特性，導(dǎo)致其在多種疾病尤其是在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，它們?cè)贜PC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用和潛在機(jī)制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)源自PVT1基因的circPVT1在NPC中高豐度，circPVT1可能是是鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能作為鼻咽癌診斷和治療的新生物標(biāo)志物或靶點(diǎn)。探究circRNA在NPC中的調(diào)節(jié)機(jī)制能夠?yàn)閺V大NPC患者的早期診斷和治療預(yù)后提供新思路。

2022年10月5日，中南大學(xué)腫瘤研究所副所長(zhǎng)向波教授在Molecular Cancer發(fā)表了題為Circular RNA circPVT1 promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis via the β-TrCP/c-Myc/SRSF1 positive feedback loop的文章。在本項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)circPVT1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。機(jī)制上，circPVT1通過(guò)與β-TrCP（一種E3泛素連接酶）結(jié)合來(lái)抑制c-Myc的蛋白酶體降解，從而改變了鼻咽癌細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞粘附，最終促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，c-Myc轉(zhuǎn)錄可以上調(diào)SRSF1（一種RNA剪接因子）的表達(dá)，增強(qiáng)circPVT1生物合成形成正反饋。本文的研究結(jié)果揭示了circPVT1在NPC進(jìn)展中的重要作用，circPVT1可作為鼻咽癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

1.?鼻咽癌中circPVT1的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)

作者結(jié)合兩組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析得出circPVT1在NPC中顯著高表達(dá)，qRT-PCR和Sanger測(cè)序?qū)嶒?yàn)證實(shí)circPVT1來(lái)自8號(hào)染色體的一個(gè)lncRNA基因PVT1通過(guò)反向剪接形成。核質(zhì)分離試驗(yàn)和熒光原位雜交證實(shí)circPVT1主要分布在細(xì)胞質(zhì)，作者利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circPVT1在NPC組織中高表達(dá)，原位雜交也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。另外，circPVT1的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后、臨床分期、N分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，circPVT1在鼻咽癌組織中有較高的表達(dá)并參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

2.?circPVT1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲和轉(zhuǎn)移

作者利用過(guò)表達(dá)/敲低實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)探究circPVT1對(duì)NPC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)circPVT1后，NPC細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，而對(duì)NPC的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖沒(méi)有影響。作者建立過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的肺轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)circPVT1過(guò)表達(dá)組的肺結(jié)節(jié)數(shù)量顯著高于對(duì)照組。然后，作者通過(guò)裸鼠腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型、發(fā)現(xiàn)circPVT1組的腹股溝淋巴結(jié)大于對(duì)照組，IHC實(shí)驗(yàn)表明circPVT1組淋巴結(jié)中泛細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著高于circPVT2敲除組。這些結(jié)果表明，circPVT1在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.?circPVT1通過(guò)結(jié)合β-TrCP促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲

作者為了探究circPVT1在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，利用生物素標(biāo)記的circPVT1探針下調(diào)circPVT1鑒別了PVT1周圍的結(jié)合蛋白，并利用RNA下拉實(shí)驗(yàn)、RIP實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)等方法發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了β-TrCP與circPVT1中230-280nt的片段結(jié)合作用。作者利用RNA下拉和RIP實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circPVT1與β-TrCP的結(jié)合位點(diǎn)為β-TrCP的WD40結(jié)構(gòu)域。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，過(guò)表達(dá)β-TrCP可以抑制NPC細(xì)胞的遷移和侵襲。綜上所述，circPVT1與β-TrCP的WD40結(jié)構(gòu)域相互作用，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

4.?c-Myc與β-TrCP結(jié)合并充當(dāng)其泛素化底物

作者過(guò)表達(dá)或敲低circPVT1后發(fā)現(xiàn)circPVT1不影響β-TrCP的表達(dá)，所以推測(cè)circPVT1可能通過(guò)影響β-TrCP與其底物的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其下游蛋白的表達(dá)。作者運(yùn)用Co-IP實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析等技術(shù)鑒定了260種蛋白，發(fā)現(xiàn)c-Myc對(duì)β-TrCP表現(xiàn)出高親和力。經(jīng)過(guò)一系列的Co-IP證實(shí)了β-TrCP的WD40結(jié)構(gòu)域與c-Myc之間的結(jié)合。作者還發(fā)現(xiàn)β-TrCP的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞中c-Myc的泛素化，并降低了c-Myc蛋白水平。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)表明，β-TrCP的過(guò)度表達(dá)抑制了NPC細(xì)胞的遷移和侵襲性。

5. circPVT1阻斷β-TrCP與c-Myc的結(jié)合并抑制c-Myc泛素化

作者發(fā)現(xiàn)Co-IP結(jié)果提示β-TrCP的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域可能占據(jù)了c-Myc結(jié)合所必需的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致β-TrCP泛素化程度降低。所以作者又進(jìn)行了Co-IP、RNA下拉、過(guò)表達(dá)/敲除等操作，發(fā)現(xiàn)β-TrCP的WD40重復(fù)序列與C-Myc和circPVT1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。在NPC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circPVT1降低了β-TrCP與c-Myc的相互作用，原因是減少了c-Myc與β-TrCP的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。circPVT1的過(guò)表達(dá)會(huì)顯著抑制c-Myc蛋白的泛素化，c-Myc蛋白的穩(wěn)定性也隨之增加。以上結(jié)果表明，circPVT1通過(guò)與β-TrCP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷β-TrCP與c-Myc的相互作用，從而穩(wěn)定c-Myc蛋白，從而阻止β-TrCP介導(dǎo)的泛素化和c-Myc的降解。

6.?circPVT1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和細(xì)胞骨架重塑促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了進(jìn)一步探索下游基因，作者使用質(zhì)譜儀檢測(cè)circPVT1過(guò)表達(dá)后的蛋白質(zhì)組圖譜，對(duì)鑒定出的231個(gè)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)大部分與細(xì)胞粘附、細(xì)胞連接、細(xì)胞骨架相關(guān)。作者還通過(guò)上游因子分析發(fā)現(xiàn)，這其中與受c-Myc調(diào)控的蛋白不在少數(shù)。因此，原子力顯微鏡檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)后的NPC細(xì)胞硬度和粘附性降低。進(jìn)一步試驗(yàn)表明circPVT1可以誘導(dǎo)RhoA、RhoC和Vimentin的表達(dá)，而降低E-鈣粘蛋白的表達(dá)，這些都是細(xì)胞黏附連接和細(xì)胞骨架重塑途徑有關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵分子。而c-Myc的下調(diào)則逆轉(zhuǎn)了circPVT1誘導(dǎo)的RhoA、RhoC和Vimentin的上調(diào)，以及PVT1周圍E-鈣粘蛋白表達(dá)的降低。綜上所述，細(xì)胞黏附連接和細(xì)胞骨架重塑是通過(guò)PVT1/β-TrCP/c-Myc軸來(lái)調(diào)節(jié)的。

7.?c-Myc通過(guò)上調(diào)和募集SRSF1促進(jìn)CircPVT1生物合成

最后為了探明整個(gè)通路，作者運(yùn)用c-Myc過(guò)表達(dá)/敲除、qRT-PCR、生信分析等方法，發(fā)現(xiàn)了circPVT1啟動(dòng)子區(qū)有三個(gè)c-Myc潛在結(jié)合位點(diǎn)，過(guò)表達(dá)c-Myc可以增加circPVT1的轉(zhuǎn)錄水平，熒光素酶報(bào)告和ChIP-qPCR結(jié)果表明c-Myc可以促進(jìn)circPVT1的轉(zhuǎn)錄。作者利用生信預(yù)測(cè)、RIP、過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了剪接因子SRSF1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中circPVT1的生物發(fā)生。Co-IP實(shí)驗(yàn)揭示了c-Myc和SRSF1之間的相互作用，c-Myc可以作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)SRSF1的表達(dá)。IHC結(jié)果顯示circPVT1的強(qiáng)度與NPC組織中c-Myc和SRSF1的水平呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，c-Myc不僅作為促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，而且還增強(qiáng)了circPVT1前體的剪接，從而通過(guò)將轉(zhuǎn)錄與剪接結(jié)合促進(jìn)了circPVT1的生物合成。

小結(jié)

該項(xiàng)研究探明了circPVT1在鼻咽癌細(xì)胞中的調(diào)節(jié)機(jī)制，證實(shí)了circPVD1通過(guò)與β-TrCP的結(jié)合抑制了泛素介導(dǎo)的c-Myc降解，這阻斷了泛素E3連接酶β-TrCP與其靶c-Myc之間的相互作用，與此同時(shí)circPVT1還受到c-Myc和SRSF1的正向共調(diào)節(jié)。整個(gè)通路也是導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)，并最終促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵入的原因所在。該研究為鼻咽癌進(jìn)展機(jī)制和鼻咽癌患者治療的潛在靶點(diǎn)提供了新的見(jiàn)解。

原文鏈接

https://doi.org/10.1186/s12943-022-01659-w

參考文獻(xiàn)

[1] Chen, Y.-P. et al.?Nasopharyngeal carcinoma. The Lancet?394, 64–80 (2019).

[2] Wang, Y. et al.?The influence of circular RNAs on autophagy and disease progression. Autophagy?18, 240–253 (2022).

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