寫在前面

????????今天推薦的是由美國(guó)諾華制藥生物醫(yī)學(xué)研究所在2019年9月13日發(fā)表于Nature Communications （IF：12.117，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Feng Cong教授，研究表明USP7通過促進(jìn)Axin的穩(wěn)定性來抑制Wnt /β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。

研究背景

????????Axin是負(fù)責(zé)形成β-catenin破壞復(fù)合物的關(guān)鍵支架蛋白。Axin蛋白的穩(wěn)定性受到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而Axin蛋白細(xì)胞濃度的調(diào)節(jié)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)具有深遠(yuǎn)的影響。盡管已鑒定出促進(jìn)Axin泛素化的E3，但負(fù)責(zé)Axin泛素化和穩(wěn)定的去泛素酶仍是未知的。

摘要部分

????????作者通過CRISPR篩選將USP7鑒定為Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控蛋白。USP7的遺傳消融或藥理抑制作用可在多個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)中穩(wěn)步提高Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。USP7通過其TRAF結(jié)構(gòu)域直接與Axin相互作用，并促進(jìn)Axin的去泛素化和穩(wěn)定化。另一方面，USP7的抑制通過增加Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化。?

????????作者的研究揭示了一種關(guān)鍵機(jī)制，該機(jī)制可防止Axin過度降解，并將USP7識(shí)別為使細(xì)胞對(duì)Wnt /β-catenin信號(hào)敏感的靶標(biāo)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP7是Wnt /β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效負(fù)調(diào)節(jié)器??? ? ?

????????為了發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)的未知調(diào)控因子，作者在穩(wěn)定表達(dá)Cas9和具有多個(gè)TCF結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄報(bào)告子SuperTopFlash-GFP（STF-GFP）的HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組CRISPR篩選。在該報(bào)告系統(tǒng)中USP7被認(rèn)定為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)器。為了驗(yàn)證篩選結(jié)果，作者通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將獨(dú)立的USP7 gRNA引入HEK293T細(xì)胞，并用Wnt3a CM處理USP7敲除細(xì)胞庫并進(jìn)行FACS分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP7敲除顯著增強(qiáng)了HEK293T細(xì)胞中Wnt3a誘導(dǎo)的STF-GFP。同時(shí)，USP7的敲除增強(qiáng)了Wnt3a誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞中活性β-catenin的積累。

????????接下來，作者試圖確定USP7的過表達(dá)是否影響Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。相比對(duì)照組，USP7（WT）的異位表達(dá)強(qiáng)烈抑制Wnt3a誘導(dǎo)的STF報(bào)告基因和β-連環(huán)蛋白的積累。USP7 C223A突變體的異位表達(dá)則略微增加了Wnt3a誘導(dǎo)的STF報(bào)告基因。此外，作者通過將野生型USP7和C223A突變體重新引入U(xiǎn)SP7基因敲除的HEK293T STF-GFP細(xì)胞中進(jìn)行了回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。USP7敲除細(xì)胞表達(dá)高水平的STF-GFP，其被野生型USP7強(qiáng)烈抑制，但未被C223A突變體抑制。

研究結(jié)論：USP7負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，并且該功能取決于其去泛素酶活性。

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2.USP7抑制劑增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)

????????接下來作者作者使用STF-Luc測(cè)定法和Cell Titer-Glo（CTG）測(cè)定法以劑量反應(yīng)方式測(cè)量了各種USP7抑制劑對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖的影響。所有新一代USP7抑制劑，包括Almac430，Almac4732，P5042931，F(xiàn)T67129和GNE-677633，均增加了STF報(bào)告基因。Almac4和Almac47具有最強(qiáng)的Wnt刺激活性。在所有測(cè)試濃度下，兩種化合物均不影響HEK293T USP7 KO細(xì)胞的增殖，這表明Almac4和Almac47的脫靶活性最低。這些數(shù)據(jù)共同表明，USP7的藥理學(xué)抑制作用增強(qiáng)了不同細(xì)胞系中的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。

研究結(jié)論：USP7抑制劑可增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。

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3.USP7促進(jìn)Axin的去泛素化和穩(wěn)定化??? ?

????????Axin是β-catenin破壞復(fù)合物的關(guān)鍵支架蛋白，Axin濃度的調(diào)節(jié)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)具有深遠(yuǎn)的影響。作者研究發(fā)現(xiàn)，在沒有外源性Wnt的情況下，敲除USP7會(huì)降低AXIN1的表達(dá)，但不會(huì)降低β-catenin破壞復(fù)合物的其他成分。接下來，作者檢測(cè)了USP7基因敲除對(duì)Wnt誘導(dǎo)的Axin降解的影響。Wnt3a增加了AXIN1的降解，并且通過USP7敲除進(jìn)一步增強(qiáng)了這種作用。同時(shí)， 野生型USP7的過表達(dá)增加了HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)的Axin1蛋白的蛋白水平。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，USP7通過抑制其蛋白酶體降解來穩(wěn)定Axin蛋白。

????????由于USP7通過促進(jìn)其去泛素作用來穩(wěn)定其底物，因此作者研究了USP7是否會(huì)影響Axin的泛素化。研究發(fā)現(xiàn)，野生型USP7的過表達(dá)降低了異位表達(dá)的Axin1的多聚泛素化作用。接下來，作者通過體外去泛素化試驗(yàn)證實(shí)了Axin是USP7的直接底物。不僅如此，研究結(jié)果表明USP7的過表達(dá)抑制了RNF146或SIAH1誘導(dǎo)的Axin的多聚泛素化。

研究結(jié)論：這些結(jié)果表明，USP7通過抵消RNF146和SIAH1誘導(dǎo)的泛素化和Axin的降解來抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。

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4.USP7中的TRAF結(jié)構(gòu)域與Axin結(jié)合

????????USP7在Axin1串聯(lián)親和力蛋白質(zhì)純化質(zhì)譜篩查系統(tǒng)中獲得了成功。接下來，作者檢查了USP7的哪個(gè)域負(fù)責(zé)Axin相互作用。USP7包含三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)氨基末端腫瘤壞死相關(guān)因子樣（TRAF）結(jié)構(gòu)域，一個(gè)中間催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基末端串聯(lián)UBL結(jié)構(gòu)域（TUD），其中包含五個(gè)泛素樣折疊。如圖4d所示，Axin1與USP7的TRAF結(jié)構(gòu)域（而非TUD結(jié)構(gòu)域）共免疫沉淀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，USP7的TRAF域與AXIN1和AXIN2相互作用的方式類似于與其他USP7底物的結(jié)合方式。

研究結(jié)論：USP7通過其TRAF域直接與Axin1的多個(gè)位點(diǎn)相互作用。

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5.USP7抑制Wnt誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化

????????由于USP7負(fù)調(diào)控Wnt信號(hào)，作者研究了USP7在小鼠多能間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST2中成骨細(xì)胞分化中的功能。Almac4的處理增強(qiáng)了C3H10T1/2和ST2細(xì)胞中Wn3a誘導(dǎo)的堿性磷酸酶染色。同樣的，Almac4增加了C3H10T1/2和ST2細(xì)胞中Wnt3a誘導(dǎo)的堿性磷酸酶（Alpl）和β-catenin靶基因Axin2和Lef1的mRNA水平。接下來，作者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ODM增加了C3H10T1/2細(xì)胞中活性β-catenin的水平，而USP7抑制劑Almac4進(jìn)一步增強(qiáng)了該活性。在存在ODM的情況下，C3H10T1/2和ST2細(xì)胞中USP7的基因敲除或藥理抑制作用增加了堿性磷酸酶染色和Alpl和β-catenin靶基因的mRNA表達(dá)。

研究結(jié)論：USP7通過減弱Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制成骨細(xì)胞分化。

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6.USP7通過抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化

????????眾所周知，Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制脂肪細(xì)胞分化。作者研究了USP7在使用小鼠前脂肪細(xì)胞細(xì)胞系3T3-L149的脂肪細(xì)胞分化中的作用。與C3H10T1/2和ST2不同， 3P3-L1的增殖不受USP7抑制。使用獨(dú)立的gRNA敲除Usp7增強(qiáng)了Wnt3a誘導(dǎo)的活性β-連環(huán)蛋白的積累。USP7抑制劑Almac4的治療也增加了活性β-catenin的積累。這些結(jié)果表明，USP7抑制3T3-L1細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。接下來，作者研究了USP7在用脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理過的3T3-L1細(xì)胞中β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基降低了3T3-L1細(xì)胞中胞質(zhì)β-catenin的水平。這些結(jié)果表明，USP7敲除增加了用脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。與Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)阻滯脂肪細(xì)胞分化的觀點(diǎn)一致，USP7敲除強(qiáng)烈抑制脂肪細(xì)胞分化介質(zhì)誘導(dǎo)的脂滴形成和成脂標(biāo)記物的表達(dá)。

研究結(jié)論：USP7抑制主要通過激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)來阻止脂肪細(xì)胞分化。

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結(jié)論與討論

????????作者證實(shí)USP7是通過CRISPR篩選產(chǎn)生的Wnt信號(hào)的有效負(fù)調(diào)控因子。USP7通過其TRAF結(jié)構(gòu)域與Axin進(jìn)行物理相互作用，并充當(dāng)Axin的真正去泛素酶。通過去除多聚泛素修飾,USP7可穩(wěn)定Axin蛋白并抑制Wnt誘導(dǎo)的β-catenin積聚。USP7的遺傳和藥理抑制作用可增強(qiáng)WVnt/B-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，并調(diào)節(jié)Wnt依賴性成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-12143-3