質(zhì)譜流式技術(shù)（Mass Cytometry）在藥物開發(fā)和生物藥物表征中的潛力巨大。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)將質(zhì)譜技術(shù)與流式細(xì)胞儀相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的生化成分進(jìn)行深入研究，幫助我們理解疾病機(jī)制，驗(yàn)證藥物的效果，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)以及增強(qiáng)生物制藥質(zhì)量控制。這在生物藥物表征中非常有用，它可以幫助解決以下一些問題：

單細(xì)胞層次的分子表征：傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)通常需要大量的樣本以獲取可靠的結(jié)果，而質(zhì)譜流式技術(shù)則可以分析單個(gè)細(xì)胞的生化成分，這可以幫助我們更深入地理解細(xì)胞的生物學(xué)特性。

生物分子的定量分析：質(zhì)譜流式技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物分子進(jìn)行定量分析，包括蛋白質(zhì)、代謝物和其他生物分子。

細(xì)胞異質(zhì)性的研究：細(xì)胞群體中的細(xì)胞并非完全相同，它們之間的差異可能影響疾病的發(fā)展和治療的效果。質(zhì)譜流式技術(shù)可以幫助我們研究這種細(xì)胞異質(zhì)性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細(xì)胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細(xì)胞質(zhì)譜分析，該平臺(tái)能夠完成包括單細(xì)胞捕獲、cDNA合成、實(shí)時(shí)定量PCR分析、目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增以及質(zhì)譜流式細(xì)胞分析。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式細(xì)胞儀（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于單細(xì)胞質(zhì)譜分析，該平臺(tái)能夠完成包括單細(xì)胞捕獲、cDNA合成、實(shí)時(shí)定量PCR分析、目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增以及質(zhì)譜流式細(xì)胞分析。

相較于傳統(tǒng)流式，質(zhì)譜流式的特點(diǎn)在于包含巨大的信息量。質(zhì)譜流式提供的高維數(shù)據(jù)能夠檢查單個(gè)樣本中大量細(xì)胞亞群的特征、研究已知細(xì)胞群內(nèi)的異質(zhì)性、識(shí)別與臨床狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞群變化、評(píng)估靶細(xì)胞群與已知參考群體的相似性、確定細(xì)胞群生理狀態(tài)的變化、識(shí)別發(fā)育途徑中的中間狀態(tài)或分支點(diǎn)。

1、質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)導(dǎo)出

使用質(zhì)譜流式儀器檢測(cè)的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行數(shù)據(jù)合并、校正、歸一化等數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換操作后方可導(dǎo)出，導(dǎo)出的文件格式為FCS（圖2）。

質(zhì)譜流式原始數(shù)據(jù)通常以具有不同表達(dá)范圍的偏態(tài)分布為特征。由于可視化和聚類性能取決于規(guī)模和分布，使表達(dá)峰盡可能接近正態(tài)分布非常重要。因此，表達(dá)值通常使用反雙曲正弦（arcsinh）變換進(jìn)行變換，輔因子分別通常5。arcsinh 轉(zhuǎn)換的行為類似于高值時(shí)的對(duì)數(shù)變換，但在接近零時(shí)近似線性，并且輔助因子控制線性區(qū)域的寬度。由于背景噪聲、自發(fā)熒光和補(bǔ)償?shù)男Ｕ?，傳統(tǒng)流式數(shù)據(jù)包含更多的負(fù)值;相反，當(dāng)未檢測(cè)到離子時(shí)，質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)包含零值，并且由于背景減法和隨機(jī)化而引入的負(fù)值很少。

對(duì)于不同時(shí)間檢測(cè)數(shù)據(jù)的可比性，質(zhì)譜流式引入了基于beads的歸一化。該算法使用市售校準(zhǔn)微球（EQ beads），加入并與樣品一起采集。因此，可以通過采集時(shí)間跟蹤信號(hào)的變化。在數(shù)據(jù)處理過程中，識(shí)別beads并在所有文件中以定義的時(shí)間間隔計(jì)算beads的中值強(qiáng)度。根據(jù)獲得的值，計(jì)算每個(gè)beads的全局平均值并將其用作目標(biāo)值。為了獲得變換因子，使用全局均值和區(qū)間特定強(qiáng)度計(jì)算線性模型。然后將該因子應(yīng)用于所有細(xì)胞事件，并插值到相應(yīng)間隔和文件中的所有標(biāo)記。

2、質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)預(yù)處理

在傳統(tǒng)流式中，通常使用FSC參數(shù)高度（H）和面積（A）消除雙峰，超出對(duì)角線的事件被定義為雙峰，因?yàn)樗鼈兊奶卣魇切盘?hào)曲線的高度相同但面積不同。在質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)中，通常使用cytobank或FlowJo對(duì)細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，其中順鉑用于區(qū)分活細(xì)胞，Cell-ID intercalator Ir同于區(qū)分單個(gè)細(xì)胞。圈出單個(gè)活細(xì)胞群進(jìn)行后續(xù)分析（圖3）。

也可以使用例如flowWorkspace包將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R環(huán)境中進(jìn)行自動(dòng)門控。如果已有某些文件提供了門控策略，則可以使用像flowLearn這樣的半監(jiān)督門控方法來重現(xiàn)其余數(shù)據(jù)的門控策略，該算法使用提供的門控閾值作為輸入，并使用基于導(dǎo)數(shù)的密度對(duì)齊將它們傳輸?shù)狡溆鄻颖尽Ｏ駀lowStats，flowDensity或OpenCyto（用于構(gòu)建自動(dòng)門控層次結(jié)構(gòu)的框架）這樣的軟件包對(duì)于構(gòu)建用戶定義的門控策略很有用。自動(dòng)門控的方法更適用于大樣本的處理過程。

除了導(dǎo)出單個(gè)活細(xì)胞數(shù)據(jù)，也可以對(duì)感興趣的某類細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門導(dǎo)出（圖4）。

在圈門前需要確認(rèn)在數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換導(dǎo)出過程中是否把EQ beads的數(shù)據(jù)去除，如果未去除，則在圈單個(gè)活細(xì)胞前加一步去除beads的操作（圖5）。

導(dǎo)出細(xì)胞亞群后，可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的降維聚類等分析（表1）。

表1. 質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)常用的數(shù)據(jù)分析方法舉例

降維方法的目標(biāo)是將高維數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)保留在較低的、更易于解釋的二維或三維地圖中。這些方法可分為線性工具和非線性工具。由PCA（主成分分析），表示的線性方法側(cè)重于將點(diǎn)的最大方差保持在較低空間中，從而使不同的點(diǎn)彼此遠(yuǎn)離。另一方面，非線性算法如t-SNE（t-隨機(jī)鄰居嵌入）及其衍生算法，使相似的細(xì)胞彼此靠近，專注于保持局部關(guān)系。一些工具，如t-SNE和UMAP將眾所周知的群體分開，可以很好地概述了現(xiàn)有細(xì)胞。其他方法，如Isomap（等距特征映射）或擴(kuò)散圖可視化分化軌跡，因?yàn)樗鼈兡軌虮Ａ艏?xì)胞之間的局部和全局距離。

基于聚類的算法對(duì)相似的細(xì)胞進(jìn)行分組，并使用可視化工具在低維空間中表示它們。在選擇最佳聚類方法時(shí)，應(yīng)考慮幾個(gè)要求，例如需要縮減采樣、可重復(fù)性、稀有細(xì)胞檢測(cè)和運(yùn)行時(shí)間。不同的分析方法具有不同的特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自行選擇分析方法。2019發(fā)表的一篇文章在六個(gè)質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)集上測(cè)試了七種無監(jiān)督方法（Accense、Xshift、PhenoGraph、FlowSOM、flowMeans、DEPECHE和kmeans）和兩種半監(jiān)督方法（自動(dòng)細(xì)胞類型發(fā)現(xiàn)和分類（ADCC）以及線性判別分析 （LDA）），計(jì)算所有定義的性能度量，并將其與隨機(jī)子抽樣、不同的樣本大小以及每種方法的聚類數(shù)進(jìn)行比較（圖5）。

在準(zhǔn)確性（precision）上，研究人員將“manual gating”的細(xì)胞分群結(jié)果看作“ground truth”，利用四種外部評(píng)價(jià)指標(biāo)（Accuracy，F(xiàn)-measure， NMI和ARI），對(duì)不同方法的分群準(zhǔn)確性和效率進(jìn)行了討論。討論發(fā)現(xiàn)，LDA是準(zhǔn)確性比較高的半監(jiān)督分群方法，無監(jiān)督方法中FlowSOM和flowMeans的準(zhǔn)確性較高，其次是PhenoGraph和DEPECHE方法。

在一致性（coherence）上，不再考慮“manual gating”的細(xì)胞分群結(jié)果，而是直接利用三種內(nèi)部評(píng)價(jià)指標(biāo)（DB，CH和XB），對(duì)每個(gè)方法揭示細(xì)胞數(shù)據(jù)內(nèi)部本質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力進(jìn)行了探討。經(jīng)過探討發(fā)現(xiàn)，DEPECHE，F(xiàn)lowSOM和PhenoGraph方法能更好地捕捉到CyTOF數(shù)據(jù)的內(nèi)部本質(zhì)結(jié)構(gòu)。

在穩(wěn)定性（stability）上，根據(jù)細(xì)胞采樣數(shù)量的變化，研究人員對(duì)不同方法在分群準(zhǔn)確性上的魯棒性和不同方法識(shí)別出的細(xì)胞亞群數(shù)量的魯棒性進(jìn)行了深入研究。綜合來說，PhenoGraph，DEPECHE和LDA具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性，而FlowSOM在分析較大的CyTOF數(shù)據(jù)時(shí)更加魯棒。此外，這篇文章還研究了分群方法的分群分辨率，發(fā)現(xiàn)PhenoGraph和Xshifit能夠?qū)μ囟ǖ募?xì)胞亞型細(xì)化分類（識(shí)別出更細(xì)粒度的亞群），而DEPECHE更傾向于忽略細(xì)胞亞型之間的差異，將不同的T細(xì)胞或B細(xì)胞合并到一個(gè)細(xì)胞亞群（識(shí)別粗粒度的亞群）。

總的來說，文章結(jié)果表明，LDA最精確地再現(xiàn)了手動(dòng)標(biāo)簽，但在評(píng)估中排名不高。PhenoGraph和FlowSOM在精度，連貫性和穩(wěn)定性方面優(yōu)于其他無監(jiān)督工具。PhenoGraph和Xshift在檢測(cè)精細(xì)的子集群時(shí)具有優(yōu)勢(shì)，而DEPECHE和FlowSOM傾向于將相似的集群分組到元集群中。PhenoGraph、Xshift和flowMeans的性能受到樣本量增加的影響，但隨著樣本量的增加，F(xiàn)lowSOM相對(duì)穩(wěn)定（圖6）。

2023年在Nature Communications上發(fā)表的一篇文章在對(duì)425種質(zhì)譜流式數(shù)據(jù)降維方法的性能進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試。結(jié)果表明像SAUCIE，SQuaD-MDS和scvis這樣鮮為人知的方法總體上表現(xiàn)最佳。特別是SAUCIE和SCVIS平衡良好，SQuaD-MDS在結(jié)構(gòu)保持方面表現(xiàn)出色，而UMAP具有出色的下游分析性能。t-SNE（以及SQuad-MDS/t-SNE雜交種）具有最佳的局部結(jié)構(gòu)保存。該研究的結(jié)果反駁了該領(lǐng)域的普遍想法，即tSNE和UMAP是scRNA-seq數(shù)據(jù)的最佳表現(xiàn)者，也是CyTOF數(shù)據(jù)的最佳選擇。并且數(shù)據(jù)降維工具之間存在顯著的互補(bǔ)性，方法的選擇應(yīng)取決于底層數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和分析需求（圖7）。

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