這篇是寫石蠟切片的免疫組化和免疫熒光~~~

之前做了冰凍切片，最近在做石蠟切片，我的石蠟切片都是讓公司十塊錢一個進行包埋，然后自己切的，也可以直接讓公司給你切，至于石蠟和冰凍的區(qū)別如下

切片：1.切片前一晚把蠟塊凍在-30過夜，這樣第二天切的話就比較好切

????????????2.切片就是操作機器了，是技術(shù)活，我的左手非常不靈敏，所以操作就是真的慢啊

????????????3.切完之后要放在60°烘箱，烤1小時，然后就可以常溫儲存啦

開始啦~~

2-13步，全程注意不要干片！

1. 將石蠟切片放入烘箱，70°烤片2-3h；

   
   

2.室溫脫蠟、水化：通風(fēng)櫥內(nèi)，將切片置于 a槽：二甲苯10min；b槽：二甲苯10min；c槽：無水乙醇，5min；d槽：無水乙醇，5min；e槽：95%酒精，5min；f槽：85%酒精，5min；g槽：75%酒精，5min；h槽：50%酒精，5min；

此步驟是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

3.熱抗原修復(fù)：將經(jīng)過脫蠟的切片先置于水中，預(yù)熱抗原修復(fù)液（檸檬酸鈉粉末配置的，一包配兩升）我用的是蒸蛋器，實驗室的師兄師姐，高壓鍋，微波爐，水浴鍋，用啥的都有，emmm就就地取材吧，預(yù)熱一會，然后把切片放入預(yù)熱好的抗原修復(fù)液中，然后蒸煮30min，也可以根據(jù)具體情況，適當(dāng)延長抗原修復(fù)時間，然后自然冷卻室溫；

為了得到更好的實驗結(jié)果，在獲得樣本后，會對其進行固定，一般常用的就是福爾馬林或者多聚甲醛溶液?？茖W(xué)研究已經(jīng)證明甲醛的醛基與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，不同程度的遮蔽了抗原表面的抗原決定簇，影響其與抗體結(jié)合。其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成的究竟是什么還沒有定論，有人說形成的是醛基，有人說形成的是羧甲基。但不管是什么，都會使抗原表面的決定簇減少，影響實驗結(jié)果，甚至產(chǎn)生假陽性。

4.置于水中，搖床洗5min，免疫組化筆畫圈，注意：一定避免干片，畫完先放入水中，然后把片子，擺入濕盒，一起加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（要完全覆蓋組織，目的是去除內(nèi)源性過氧化物酶），15min；

5.PBS洗三次，每次5min；

6.封閉：5%BSA封閉1h（注意，這里的BSA是用PBST配置的，0.1％PBST：PBS加0.1％的吐溫）；

7.孵一抗：相應(yīng)的抗體按照protocol的比例用步驟6中的BSA稀釋，甩掉封閉液，加上一抗，4°過夜；

8.將過夜孵育一抗的片子拿出來臺面放置10min，恢復(fù)室溫；

9.回收一抗，PBS洗三次，每次8min；

10.滴加二抗，37°半小時；

11.PBS洗三次，每次8min；

12.顯色:加入DAB顯色劑(現(xiàn)配現(xiàn)用，即底物液加20份濃縮DAB溶液1份)室溫孵育1-10min，在顯微鏡下觀察陽性對照顯色情況，待出現(xiàn)理想陽性顯色且無明顯背景時終止顯色；

＋蘇木素染核，加上幾秒，流水洗掉就可（不要對著直沖）；

原理是在HRP的催化下，H?O?將DAB氧化成還原型的DAB,還原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀

13.用水洗2次，各3min；

14.脫水透明:75%酒精3min，85%酒精3min，95%酒精3min，無水乙醇3min，二甲苯透明5min，換用新鮮的二甲苯再透明3min；

15.晾干后，用中性樹膠封片。

然后就可以鏡下觀察了~~~~~