牙周炎是一種全球性的慢性多因素炎癥性疾病，與牙齒生物膜有關(guān)，其特征是牙周支持組織（包括牙周膜和牙槽骨）的進(jìn)行性破壞。牙周微生物群落和宿主免疫炎癥反應(yīng)之間的失調(diào)被認(rèn)為是牙周炎的主要原因。巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展和消退中起著重要的免疫反應(yīng)作用。在炎癥或其他環(huán)境刺激下，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 通過其分泌組發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來源于脂多糖（LPS）預(yù)處理或三維（3D）培養(yǎng)的MSCs的分泌組通過誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，顯著降低包括牙周炎在內(nèi)的炎癥疾病的炎癥反應(yīng)。

天津醫(yī)科大學(xué)隋磊和趙艷紅研究團(tuán)隊(duì)在INT J MOL SCI雜志上發(fā)表題為“Regulatory Effects of Three-Dimensional Cultured Lipopolysaccharide-Pretreated Periodontal Ligament Stem Cell-Derived Secretome on Macrophages”的研究成果。在該研究中，作者構(gòu)建了PDLSC–SupraGel培養(yǎng)系統(tǒng)，并在LPS預(yù)處理經(jīng)3D培養(yǎng)后收集牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）衍生的分泌組，以驗(yàn)證分泌組對巨噬細(xì)胞極化和遷移的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)還利用多因子技術(shù)檢測了分泌組中的免疫細(xì)胞因子的變化，以推測巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，試圖為巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)牙周炎等炎癥性疾病的無細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。其中，中科新生命為本研究提供了多重細(xì)胞因子檢測服務(wù)。

?研究材料

牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的細(xì)胞上清，n=12

?技術(shù)路線

步驟1：不同濃度LPS預(yù)處理對PDLSCs的影響；

步驟2：PDLSC–SupraGel培養(yǎng)體系的構(gòu)建；

步驟3：qRT-PCR和多細(xì)胞因子檢測驗(yàn)證LPS預(yù)處理和3D培養(yǎng)PDLSCs來源分泌組對巨噬細(xì)胞極化和遷移的影響。

?研究結(jié)果

1. LPS預(yù)處理對牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的影響

在CCK8測定分析中發(fā)現(xiàn)LPS預(yù)處理促進(jìn)了PDLSC的增殖（Fig1-A），且qRT-PCR驗(yàn)證了LPS培養(yǎng)48小時(shí)后，PDLSCs中IL-10、IDO、TSG-6、IL-6、IL-8和TGF-β mRNA的表達(dá)都呈現(xiàn)不同程度的增加（Fig1-B）。

然后，作者收集了LPS預(yù)處理的PDLSCs的條件培養(yǎng)基（CM），并用其培養(yǎng)預(yù)極化的M1巨噬細(xì)胞。結(jié)果表明，與M1巨噬細(xì)胞相比，不同濃度LPS預(yù)處理的PDLSCs衍生的CM抑制了M1標(biāo)記物iNOS的mRNA表達(dá)（p<0.05）。同時(shí)，10.0μg/mL LPS預(yù)處理的PDLSCs的CM顯著促進(jìn)了M2標(biāo)志物Arg-1的高mRNA表達(dá)（Fig2-A）。Western blot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果高度一致（Fig2-B）。

2. PDLSC–SupraGel培養(yǎng)體系的構(gòu)建

將未處理的PDLSCs和用10.0μg/mL LPS預(yù)處理的PDLSCs封裝并培養(yǎng)在SupraGel中作為三維（3D）培養(yǎng)物，并以二維（2D）培養(yǎng)作為對照。細(xì)胞活性檢測、半定量和CCK8測定分析表明，2D和3D培養(yǎng)條件下，PDLSCs在第1、3和7天具有良好的生存能力。然而，在第10天，PDLSCs球體的體積在2D培養(yǎng)板中表現(xiàn)出顯著的抑制作用，在3D培養(yǎng)中，有或沒有LPS預(yù)處理的PDLSCs增殖緩慢，沒有表現(xiàn)出增殖抑制（Fig3）。

3. 分泌組對巨噬細(xì)胞極化和遷移的影響

通過添加PBS和離心，作者成功地從SupraGel中分離出PDLSCs，并收集了來源于不同條件下生長的PDLSCs的分泌組：細(xì)胞培養(yǎng)板中的PDLSCs（2D）、細(xì)胞培養(yǎng)板中LPS預(yù)處理的PDLSCs（2D/LPS）、SupraGeel中的PDLSCs（3D）和SupraGee中LPS預(yù)處理的PDLSCs（3D/LPS）。然后使用不同條件下的分泌組來培養(yǎng)M1巨噬細(xì)胞。與單獨(dú)培養(yǎng)的M1巨噬細(xì)胞相比，分泌組培養(yǎng)的M1巨噬細(xì)胞中iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)顯著降低，而分泌組培養(yǎng)的M1巨噬細(xì)胞中Arg-1的mRNA表達(dá)顯著高于M1巨噬細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡顯示，分泌組抑制M1巨噬細(xì)胞中iNOS和CD86的表達(dá)，促進(jìn)了M1巨噬細(xì)胞中Arg-1和CD206的表達(dá)。此外，劃痕試驗(yàn)的結(jié)果顯示，分泌組顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移。

同時(shí)作者利用多重細(xì)胞因子檢測技術(shù)對2D、2D/LPS、3D和3D/LPS組衍生的分泌組進(jìn)行了免疫細(xì)胞因子測定（48種細(xì)胞因子），以研究不同的處理是否轉(zhuǎn)化為相應(yīng)分泌組中旁分泌因子含量和成分的改變。在檢測的48種細(xì)胞因子中，LPS或3D培養(yǎng)處理后，PDLSCs中參與巨噬細(xì)胞極化和分化因子、趨化因子、生長因子、炎癥細(xì)胞因子發(fā)生顯著變化（Fig5-6）。

討論

LPS作為一種常用的炎癥誘導(dǎo)劑，已在MSC預(yù)處理中進(jìn)行了研究。如上所述，LPS預(yù)處理的MSC來源的分泌組可以誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化并分泌抗炎因子，從而在炎癥性疾病的治療中發(fā)揮作用。然而，一些研究表明，LPS也可以促進(jìn)MSC的促炎表型，并逆轉(zhuǎn)其治療性免疫抑制作用。在本研究中，作者設(shè)置了一個(gè)包含LPS濃度和研究中常用的固定時(shí)間點(diǎn)的濃度梯度，以初步探討LPS濃度對PDLSCs的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10.0μg/mL LPS預(yù)處理的PDLSCs在SupraGel中具有良好的生存活力；多重細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS預(yù)處理和/或3D培養(yǎng)后，參與巨噬細(xì)胞極化、分化和趨化的細(xì)胞因子和促再生生長因子在PDLSC來源的分泌組中的表達(dá)增加，促進(jìn)了體外M2巨噬細(xì)胞極化和巨噬細(xì)胞遷移。上述結(jié)果表明，來源于3D培養(yǎng)的LPS預(yù)處理的PDLSCs的分泌組具有通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞遷移和極化來調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境向再生微環(huán)境的轉(zhuǎn)化的潛力。

多重細(xì)胞因子檢測產(chǎn)品介紹

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞（如單核、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等）和某些非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。越來越多的臨床研究證實(shí)，在免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中起重要作用。而多重細(xì)胞因子檢測技術(shù)作為一種簡單、快速、高靈敏度的檢測方式，可以滿足大批量樣本中多種細(xì)胞因子的同步檢測，不僅是基礎(chǔ)免疫研究的有較手段，同時(shí)在臨床疾病診斷、病程觀察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測方面具有重要價(jià)值。

檢測清單：

產(chǎn)品優(yōu)勢：

檢測通量高——與傳統(tǒng)ELISA單個(gè)因子檢測的通量相比，本產(chǎn)品可以一次檢測多種細(xì)胞因子，極大提高檢測通量、降低樣本量需求、節(jié)約時(shí)間及操作成本。

檢測靈敏度高——免疫因子在體內(nèi)的豐度非常低，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方式很難檢測到這類蛋白質(zhì)。而本產(chǎn)品的檢測靈敏度可達(dá)pg/ml，充分滿足免疫因子組這類低豐度蛋白質(zhì)組的檢測需求。

絕對定量——本產(chǎn)品和直接對免疫因子組進(jìn)行絕對定量，一方面避免了不同批樣本批次效應(yīng)的問題，同時(shí)也為大數(shù)據(jù)的積累和轉(zhuǎn)化（例如臨床標(biāo)志物）提供了更合適的數(shù)據(jù)形式。

樣本類型：

血清/血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織/細(xì)胞裂解液、外泌體、體液等（如眼淚、房水、灌洗液等）。

應(yīng)用領(lǐng)域：

免疫/炎癥、CRS/細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝類疾病、腫瘤微環(huán)境、Car-T/基因治療、藥效/安全性評價(jià)、類器官等。

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