? ? ? ? 今天介紹的是來(lái)自黃單胞菌(Xanthomonas)的“故事”——轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)因子(Transcription?Activator-Like?Effector，TALE)

簡(jiǎn)介

? ? ? ?轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)因子(Transcription?Activator-Like?Effector，通常被稱為TALEs，但不要與三氨基酸環(huán)擴(kuò)展同源框類蛋白質(zhì)混淆)是由一些β-和γ-變形菌綱分泌的蛋白質(zhì)。其中大部分是黃單胞菌。植物致病性黃單胞菌尤其以TALEs蛋白而聞名，TALEs是通過(guò)它們的III型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的。這些蛋白質(zhì)可以結(jié)合宿主植物的啟動(dòng)子序列，并激活植物基因的表達(dá)，以幫助細(xì)菌感染。它們通過(guò)一個(gè)由34個(gè)氨基酸重復(fù)組成的中心重復(fù)域識(shí)別植物的DNA序列。在每個(gè)重復(fù)序列中，兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸的同一性與目標(biāo)序列中的每個(gè)DNA堿基之間似乎存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。研究人員對(duì)這些蛋白質(zhì)很感興趣，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥匾魑锛膊≈械淖饔煤拖鄬?duì)容易重新定位它們以結(jié)合新的DNA序列。在青枯雷氏菌(Ralstonia solanacearum)和根瘤菌伯克霍爾德菌(Burkholderia rhizoxinica)以及尚未查明的海洋微生物中也發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白質(zhì)?！癟ALE-like”一詞是用來(lái)指假定的蛋白質(zhì)家族，包括TALEs和這些相關(guān)的蛋白質(zhì)。

黃單胞菌(Xanthomonas)

? ? ? ? 黃單胞菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，可以感染多種植物，包括辣椒、水稻、柑橘、棉花、番茄和大豆。一些類型的黃單胞菌會(huì)引起局部的葉斑病或斑紋病，而另一些則會(huì)引起系統(tǒng)性的黑腐病或葉枯病。他們通過(guò)III型分泌系統(tǒng)將許多效應(yīng)蛋白(包括TALE蛋白)注入植物體內(nèi)。TALE有幾個(gè)通常與真核生物相關(guān)的基序，包括多個(gè)核定位信號(hào)和一個(gè)酸性激活域。當(dāng)注射到植物體內(nèi)時(shí)，這些蛋白質(zhì)可以進(jìn)入植物細(xì)胞的細(xì)胞核，結(jié)合植物啟動(dòng)子序列，并激活植物基因的轉(zhuǎn)錄，幫助細(xì)菌感染植物已經(jīng)開發(fā)了一種針對(duì)III型效應(yīng)因子的防御機(jī)制，包括由這些效應(yīng)因子觸發(fā)的R(抗性)基因。其中一些R基因似乎已經(jīng)進(jìn)化到包含tal效應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，與預(yù)期目標(biāo)基因的位點(diǎn)相似。這種病原菌和寄主植物之間的競(jìng)爭(zhēng)被假設(shè)為解釋TALE DNA結(jié)合域的明顯延展性。

DNA錨定

? ? ? ?TALE最顯著的特征是中心重復(fù)域，包含1.5到33.5個(gè)重復(fù)，通常是34個(gè)殘基長(zhǎng)度(C末端重復(fù)通常較短，被稱為“半重復(fù)”)一個(gè)典型的重復(fù)序列是LTPEQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQAHG，但第12位和第13位的殘基是高度可變的(這兩個(gè)氨基酸也被稱為重復(fù)變量雙殘基或RVD)。這兩個(gè)序列重復(fù)序列與TALE靶區(qū)序列DNA堿基之間存在著簡(jiǎn)單的關(guān)系與DNA結(jié)合的TALE的晶體結(jié)構(gòu)表明，每個(gè)重復(fù)序列包括兩個(gè)α螺旋和一個(gè)含有RVD的短環(huán)，RVD的第二殘基與DNA進(jìn)行序列特異性接觸，而RVD的第一殘基則穩(wěn)定含有RVD的環(huán)。TALE的靶位點(diǎn)也往往包括第一次重復(fù)靶向的5'基側(cè)翼的胸腺嘧啶;這似乎是由于T和中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域n端保守色氨酸之間的接觸然而，這個(gè)“零”位置并不總是包含胸腺嘧啶，因?yàn)橐恍┲Ъ芨菀捉邮?/p>

? ? ? TAL-DNA在2010年被兩個(gè)獨(dú)立的小組破解。由Adam Bogdanove領(lǐng)導(dǎo)的第一個(gè)研究小組，從一個(gè)由TALEs上調(diào)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找目標(biāo)啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)序列比對(duì)和DNA序列，通過(guò)計(jì)算破解了這一密碼第二組(Boch)通過(guò)對(duì)AvrBs3激活的辣椒基因啟動(dòng)子中TAL效應(yīng)因子AvrBs3及其靶DNA序列的分子分析，推斷出該基因的編碼實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的RVD序列與目標(biāo)DNA堿基之間的編碼表達(dá)如下：

? ? ? ?NI對(duì)應(yīng)A；HD對(duì)應(yīng)C；NG對(duì)應(yīng)T與5-甲基胞嘧啶(5-M-C)；NN對(duì)應(yīng)A與G；NS與任何堿基均可配對(duì)；NK對(duì)應(yīng)G，但過(guò)多的使用會(huì)造成TALE活性的降低；NH對(duì)應(yīng)G。

生物技術(shù)

? ? ? ?TALE中的氨基酸與其靶位點(diǎn)的DNA堿基之間的簡(jiǎn)單對(duì)應(yīng)關(guān)系，使得它們?cè)诘鞍踪|(zhì)工程應(yīng)用中非常有用。許多研究小組已經(jīng)設(shè)計(jì)了人工TALE，能夠在各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中識(shí)別新的DNA序列。這樣的TALE已經(jīng)被用來(lái)創(chuàng)建人工轉(zhuǎn)錄因子，可用于靶向、激活或抑制番茄、擬南芥和人類細(xì)胞中的內(nèi)源性基因。

? ? ? ?編碼TALE蛋白的遺傳結(jié)構(gòu)可以使用傳統(tǒng)的基因合成或模塊組裝。質(zhì)粒試劑盒用于組裝定制的TALEN和其他TALE結(jié)構(gòu)，可通過(guò)公共的、非盈利的存儲(chǔ)庫(kù)Addgene獲得。

? ? ? 設(shè)計(jì)好的TALE也可以被融合到FokI的剪切域，以產(chǎn)生TAL效應(yīng)核酸酶(TALEN)或megaTALs。這種融合與鋅指核酸酶有一些共同的特性，可能在基因工程和基因治療應(yīng)用中有用。

? ? ? ?基于TALEN的方法被用于基因編輯和基因組工程等新興領(lǐng)域。TALEN在酵母、內(nèi)源性酵母基因、植物報(bào)告基因、內(nèi)源性植物基因、內(nèi)源性斑馬魚基因、內(nèi)源性大鼠基因和內(nèi)源性人類基因中表現(xiàn)出活性。人類HPRT1基因已被檢測(cè)到，但尚未定量。此外，包含F(xiàn)okI剪切域的TALEN結(jié)構(gòu)體與仍包含DNA結(jié)合域的TALE的一小部分融合，已被用于靶向人類細(xì)胞內(nèi)源性NTF3和CCR5基因，效率高達(dá)25%。TAL效應(yīng)核酸酶也被用于工程人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSCs)，并敲除秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性的ben-1基因。

? ? ? ?TALEN誘導(dǎo)的非同源末端連接修飾已被用于水稻產(chǎn)生新的抗病性。

優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

? ? ? ?TALE的優(yōu)點(diǎn)是模塊構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單，可錨定單一堿基，脫靶率比ZF低，也可以進(jìn)入線粒體內(nèi)。此外，TALE的方向與DNA序列是相同的——這是ZF做不到的。

? ? ? ? TALE的缺點(diǎn)是模塊組合復(fù)雜，具有一定細(xì)胞毒性。但TALE仍然是科研人員用于研究基因功能和潛在基因治療應(yīng)用的重要工具。

? ? ? ? 相對(duì)鋅指蛋白(Zinc Finger，ZF)而言，TALE能夠靶向更長(zhǎng)的基因序列，而且也更容易構(gòu)建。但是直到現(xiàn)在，人們一直都沒(méi)有一種低成本的而且公開能夠獲得的方法來(lái)快速地產(chǎn)生大量的TALE。

畫外音：

? ? ? ?Tale在英語(yǔ)里的意思是故事，傳說(shuō)；（對(duì)真人真事精彩的或夸張的）描述，講述；謊言；流言蜚語(yǔ)。巧合的是，轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)因子(Transcription?Activator-Like?Effector，TALE)的英文縮寫也是Tale！