WGCNA大家一定都不陌生，是一種從高通量的表達數據中挖掘模塊（module）信息的算法，在該方法中module被定義為一組具有類似表達譜的基因，并探索module內基因網絡與研究者關注的表型之間的關聯關系。

但WGCNA對于稀疏矩陣的敏感性性能相對較差，單細胞數據或者空間組學數據中固有的稀疏性和噪聲會導致虛假的基因-基因相關性。

今天給大家介紹一款基于WGCNA開發(fā)的hdWGCNA R包[1]，適用于在單細胞RNA-seq、空間轉錄組學、空間代謝組學等高維組學。

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由于單細胞或空間組學數據的相關結構對于不同的子集（細胞類型、細胞狀態(tài)、解剖區(qū)域）有很大差異，所以hdWGCNA流程考慮了這些因素，將高度相似的細胞整合成 "metacells元細胞"或者"metapixels元像素點"，以減少稀疏性，同時保留細胞的異質性。

接下來將從workflow和結果展示2部分內容來給大家做簡單介紹：

Workflow

HdWGCNA的workflow如下圖所示：

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Step1數據處理

• 在將數據導入到hdWGCNA分析前，一般會對數據做一定處理?？梢允褂肧eurat、Scanpy等R包進行處理。

• 質控，比如單細胞轉錄組數據中，對于線粒體占比高、doublet等細胞的處理；

• 數據標準化，在對數據過濾后，一般會進行Normalization操作，如Seurat默認使用通用的“LogNormalize()”方法；

• 其它如workflow中提到的“Feature selection”“Dimensionality redution”、“Batch correction”、“Clustering and annotation”都可以針對具體的項目需求，選擇性進行處理。

Step2：

metacells/metapixels的構建

這一步也是hdWGCNA中最核心的一步。Metacells定義為：代表不同細胞狀態(tài)，但feature特征相似的細胞，metapixels類似。

基于KNN bagging方法，將相似的cell進行merge。或者將鄰近ST spots進行merge。減少了數據的稀疏性，因此也增加了每個“data point”的信息。這樣降低了metacells表達譜的噪音。

Step3：設定表達矩陣

基于metacells或者metapixel的定義，得到cell/spot/pixel population矩陣。同時可以過濾掉一些在cells或者spots中一些方差為零的feature，構建矩陣用于下游的Network的構建。

Step4：Soft power閾值的篩選

同WGCNA一樣，需要進行軟閾值的篩選，軟閾值用于減少計算基因-基因相關性的噪音。

Step5：構建相關性網絡

在確定軟閾值后，進一步進行網絡構建、模塊相關性分析、TOM矩陣等分析。

Step6：計算模塊特征基因以及模塊關聯度分析

在相關性網絡中，一般會重點關注“hub gene“，即和模塊高度關聯的基因（Module Eigengene）。kME（eigengene connectivity）為特征基因連接度，用于篩選“hub gene”。

結果展示

由于hdWGCNA適用于單細胞以及空間組學（空間轉錄組、空間代謝組等）數據，鹿明已經將流程用于空間代謝組分析中。通過實際的案例，咱們來一起看看hdWGCNA的呈現結果吧！

案例共14例樣本，4例正常樣本（Normal*4），5例纖維化樣本（Fibrosis*5），5例腫瘤樣本（CA*5），通過空間代謝組樣本對應的HE染色以及空間成像圖，從各樣本中進行數據選區(qū)，并根據挑選的區(qū)域特征將所有樣本區(qū)域分為4個不同的Level層級（Group）1~4。

目標：找到從Level1到Level4中代謝物響應值逐漸增多的代謝物Modules。

1.?空間代謝組選區(qū)及樣本可視化

基于raw data在Group以及Sample維度的UMAP降維聚類圖。如下：

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在對數據進行metapixel處理后，再次進行UMAP降維聚類分析，如下：

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2.?軟閾值的選擇

計算得到最佳軟閾值為30，并繪圖展示：

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3.?Network構建

在挑選最佳軟閾值后，進行Network構建，并進行Dendrogram以及TOM（即相關性矩陣）的可視化展示分析：

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從上圖可以看出共構建出7個Module，并基于7個Module展示了Module間的聚類關系和相關性。

4.Module特征基因

在hdWGCNA中, 重點關注”Hub-Feature”, Hub-Feature即和模塊有高關聯度的這些特征。

4.1模塊kMEs可視化展示

kME (eigengene connectivity) 為特征基因連接度，用于篩選Hubgene。對各模塊Hub-Feature的kMEs進行可視化展示如下:

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對top25的Hub-Feature的hMEs進行uMAP/t-SNE可視化展示如下:

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結合1中原始umap圖，可以直觀看到各Module的Hub-Feature的分布。

4.2 模塊相關性展示

同時基于hMEs對各模塊進行相關性分析, 繪圖如下:

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上圖展示Module之間的相關性，玫紅色代表正相關，藍色代表負相關，顏色越深相關性系數值越大。

4.3 模塊內Feature特征展示

針對劃分的所有模塊，進行整體模塊內特征基因表達趨勢繪制：

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上圖從左至右，依次為模塊內特征代謝物豐度擬合圖（loess擬合）、豐度折線圖以及小提琴圖。可以看到各Module內代謝物強度在從Level1至Level4表現出不同的變化趨勢。

4.4模塊內Feature特征展示

繪制模塊Feature在不同分組/性狀的表達特征點圖, 如下:

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如上例圖展示，Level1，Level2，Level3，Level4為4個不同的選區(qū)Group分組，對應病理不同嚴重程度，Level4為腫瘤組織?？梢钥吹剑琈alignancy-M1、-M2、-M5、-M6的Features強度在Level4中最高, 是潛在的可以重點關注的Module。

4.5模塊Network

對所有模塊的Network進行可視化展示, 同時繪制各模塊內Feature的Network。以Module1（Malignaccy-M1）為例展示：

5.模塊差異分析

針對hdWGCNA分類的模塊, 進行模塊內不同表型或者分組為依據的差異分析。如分別分析Level1/Level2/Level3/Level4 和剩余3類分組在7個Module的差異。

同時繪制差異的火山圖和棒棒糖圖如下：

6.模塊和性狀的相關性

計算模塊和各性狀的相關性, 如下:

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7.模塊富集分析

同時對模塊內的Hub 代謝物進行KEGG富集分析如下:

8.空間代謝組學成像圖映射

進一步可以進行metapixels的空間上的可視化展示：

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[1] Morabito, Samuel, et al. "hdWGCNA identifies co-expression networks in high-dimensional transcriptomics data."?Cell Reports Methods?(2023).

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