前言

在過(guò)去的幾年里，RNAseq（sc-RNAseq）等單細(xì)胞分子方法徹底改變了我們對(duì)分子細(xì)胞生物學(xué)的理解。雖然該方法提供了很多生物系統(tǒng)的RNA信息，也證明了較高的臨床相關(guān)性，但是它的數(shù)據(jù)代表蛋白質(zhì)水平的能力是有限的。

2021年6月，丹麥哥本哈根大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院 John E. Dick&Bo T. Porse課題組在Nature communications期刊上發(fā)表了的題為“Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchies”的研究文章，基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)白血病細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)進(jìn)行了單細(xì)胞分析。為使用scMS研究原發(fā)性白血病和其他血液相關(guān)疾病鋪平了道路。

中文標(biāo)題：利用定量單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)表征細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)

研究對(duì)象：細(xì)胞系

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：14.919

發(fā)表時(shí)間：2021年6月7日

基于LC-MS的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（scMS）想要成為sc-RNAseq的可行替代品，作者認(rèn)為需要滿足以下三個(gè)條件：

（1）能夠在合理的時(shí)間范圍內(nèi)處理數(shù)千個(gè)細(xì)胞；

（2）就檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)量而言，覆蓋一個(gè)相似的數(shù)量級(jí)；

（3）在廣泛的細(xì)胞系統(tǒng)中易于實(shí)施。

因此，作者開(kāi)發(fā)了一種scMS實(shí)驗(yàn)流程，在通量和蛋白質(zhì)組深度方面都優(yōu)于現(xiàn)有的scMS方法。為了檢驗(yàn)新開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)流程能否檢測(cè)復(fù)雜細(xì)胞混合物中的與生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞異質(zhì)性，作者使用原發(fā)性急性髓系白血病（AML）培養(yǎng)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

研究思路

研究結(jié)果

實(shí)驗(yàn)工作流程

首先，將單細(xì)胞FACS（熒光激活細(xì)胞分選術(shù)）分選到包含裂解緩沖液（基于三氟乙醇）的384孔PCR板中的單個(gè)孔中，并記錄下每個(gè)單獨(dú)單元的FACS參數(shù)，在數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)其進(jìn)行整合。接下來(lái)，通過(guò)板內(nèi)冷凍和煮沸裂解細(xì)胞，并在過(guò)夜消化后，使用16-plex TMTPro技術(shù)標(biāo)記單細(xì)胞。在下一步驟中，將14個(gè)單細(xì)胞與助推器中的等效的200個(gè)細(xì)胞混合在一起。最后，在LC-MS分析之前使用真空離心干燥樣品。

圖1 |?scMS 工作流程的實(shí)驗(yàn)概述

評(píng)估基于升壓器的 scMS 工作流程的定量性能

由于來(lái)自單細(xì)胞的肽量很低，因此必須在單細(xì)胞通道中達(dá)到足夠的信噪比（s / n）來(lái)確保定量的準(zhǔn)確性。在基于Orbitrap的儀器上，一般通常通過(guò)使用長(zhǎng)注入時(shí)間（IT）和高的相應(yīng)的自動(dòng)增益控制（AGC）顯示參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)注射時(shí)間（IT）對(duì)單細(xì)胞信號(hào)影響，增加離子采樣的影響，蛋白質(zhì)log2 s/n值及其CV的密度等多個(gè)方面結(jié)果的比較（圖1），最終認(rèn)為300 ms和500 ms都可能產(chǎn)生具有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)，并且當(dāng)應(yīng)用于真實(shí)的scMS樣品時(shí)，這兩種設(shè)置都在蛋白質(zhì)組深度和定量性能之間取得了良好的平衡。

圖2 | 評(píng)估基于booster的scMS工作流程的定量準(zhǔn)確性

SCeptre，一個(gè)用于分析scMS數(shù)據(jù)的計(jì)算工作流程

為了能夠評(píng)估實(shí)驗(yàn)工作流程的查詢能力以及“中”（300 ms）和“高”（500 ms）儀器參數(shù)的影響，作者分析了每種方法的24個(gè)樣品，并使用新開(kāi)發(fā)的SCeptre包來(lái)處理scMS數(shù)據(jù)。作為輸入，SCeptre從蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)器和單個(gè)細(xì)胞的元信息中獲取結(jié)果文件，這是將記錄的FACS參數(shù)鏈接回每個(gè)細(xì)胞的關(guān)鍵。總的來(lái)說(shuō)，SCeptre為scMS數(shù)據(jù)分析提供了一個(gè)框架。

scMS 能夠檢測(cè) AML 層次結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞異質(zhì)性

接下來(lái)，作者測(cè)試了該流程檢測(cè)OCI-AML8227模型系統(tǒng)中已知異質(zhì)性的能力。比較了“高”（500ms）和“中”（300ms）兩個(gè)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)它們都能夠?qū)Ξ愘|(zhì)性進(jìn)行很好的分離（圖2a）。但是“高”方法在分離功率（輪廓系數(shù)）方面優(yōu)于“中”方法（圖2b）?？傮w而言，與批量測(cè)量相比，scMS測(cè)量的FC值往往要低，這表明動(dòng)態(tài)范圍有限，但是“高”數(shù)據(jù)集的結(jié)果似乎受到這些問(wèn)題的影響較小。

圖3 | 使用“中”和“高”方法檢測(cè)細(xì)胞異質(zhì)性

從 scMS 數(shù)據(jù)中提取生物信息

因?yàn)椤案摺狈椒ǖ亩繙?zhǔn)確性更高，所以使用該數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)研究。作者將原始細(xì)胞（BLAST）和白血病干細(xì)胞（LSC)和祖細(xì)胞（PROG）的組合進(jìn)行對(duì)比，找出了差異表達(dá)的蛋白。差異蛋白的基因富集分析顯示：與蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的條目在白血病干細(xì)胞（LSC)和祖細(xì)胞（PROG）組合中被富集，與髓系分化相關(guān)的條目在原始細(xì)胞中富集?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明分化階段的分離是由生物學(xué)上有意義的蛋白質(zhì)信號(hào)驅(qū)動(dòng)的，并且該工作流程能夠發(fā)現(xiàn)其中一些變化的蛋白質(zhì)。

圖4?| 從scMS數(shù)據(jù)中提取生物信息

基于無(wú)偏發(fā)現(xiàn)的多重單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)

總的來(lái)說(shuō)，這一分析證明了scMS在細(xì)胞沿分化軌跡排列方面的能力，并暗示了存在兩條平行分化路徑的可能性（圖4）。為了直接測(cè)試LSCs趨向成熟的CD34-CD38?原始細(xì)胞存在兩種不同分化途徑的可能性，研究者對(duì)LSC和祖細(xì)胞進(jìn)行了分類，并評(píng)估了它們?cè)谂囵B(yǎng)物中10天的分化情況（圖5），結(jié)果支持了LSCs可能存在兩種截然不同的分化途徑。這證明了scMS分析在揭示新的生物機(jī)制方面的能力。

圖5 | scMS概括分化軌跡

圖6 | OCI-AML8227培養(yǎng)系統(tǒng)的FACS分化測(cè)定

基集成不平衡的 scMS 數(shù)據(jù)集

作者使用Scanorama對(duì)scMS數(shù)據(jù)集進(jìn)行無(wú)監(jiān)督批量校正。為了進(jìn)一步增加LSC和祖細(xì)胞的數(shù)量，作者測(cè)量了另外一個(gè)384孔板，并使用SCeptre將兩個(gè)預(yù)富集板塊的數(shù)據(jù)集成到一個(gè)數(shù)據(jù)集中，形成了一個(gè)包含2514個(gè)細(xì)胞的917個(gè)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集。擴(kuò)散圖顯示了與大部分?jǐn)?shù)據(jù)集相似的結(jié)果（圖6），但LSC和祖細(xì)胞數(shù)量的增加加強(qiáng)了LSCs分化為祖細(xì)胞的證據(jù)。此外，還鑒定出相似的蛋白質(zhì)表達(dá)特征。

圖7 |?集成不平衡的 scMS 數(shù)據(jù)集

研究討論

通過(guò)在樣品制備、數(shù)據(jù)生成和數(shù)據(jù)分析上花費(fèi)更多精力，作者建立了一個(gè)scMS工作流程，該工作流程能夠?qū)崿F(xiàn)：（1）大約能量化每個(gè)細(xì)胞的1000個(gè)蛋白質(zhì)，（2）每天儀器時(shí)間能夠分析超過(guò)一百個(gè)細(xì)胞，（3）使用最先進(jìn)的單細(xì)胞計(jì)算算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，過(guò)濾，集成和可視化，（4）檢測(cè)細(xì)胞的異質(zhì)性和特異性蛋白質(zhì)。

總之，這項(xiàng)工作首次使用基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)白血病細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)進(jìn)行了單細(xì)胞分析。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)AML模型證明了，可以使用蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)概述FACS 數(shù)據(jù)。雖然本實(shí)驗(yàn)只專注于單個(gè)患者的白血病，但它仍然是隨后研究的良好資源，并為使用scMS研究原發(fā)性白血病和其他血液相關(guān)疾病鋪平了道路。

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大規(guī)模單細(xì)胞分析對(duì)于捕獲復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)中的生物異質(zhì)性至關(guān)重要，但僅基于RNA技術(shù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)并不能很好地代表蛋白質(zhì)水平上的變化。而單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平上破譯細(xì)胞機(jī)制并且獲得更多的信息。

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