1.BEAS-2B細(xì)胞背景

BEAS-2B細(xì)胞是從肺癌個體的正常人支氣管上皮病理切片分離出的上皮細(xì)胞。這個細(xì)胞引種自ATCC CRL-9609，又可被稱為支氣管上皮細(xì)胞。BEAS-2B細(xì)胞系最初是通過使用腺病毒12-SV40雜交病毒感染，并通過連續(xù)細(xì)胞傳代建立的永生化細(xì)胞系，它保留了對血清反應(yīng)進行鱗關(guān)分化的能力，這種能力可用于篩選誘導(dǎo)或影響分化及致癌的化學(xué)或生物制劑，因此 BEAS-2B細(xì)胞被認(rèn)為是研究藥物代謝活化作用和呼吸系統(tǒng)腫瘤以及分子機制理想的細(xì)胞模型。

2.BEAS-2B的應(yīng)用

BEAS-2B 細(xì)胞在成骨和成脂分化方面與 hMSCs 具有相似的潛力

將細(xì)胞分化誘導(dǎo)21天后，用油紅染色分化脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)液泡，然后使用茜素紅染色分化骨細(xì)胞中的鈣沉積。結(jié)果表明BEAS-2B和在成骨發(fā)生或脂肪發(fā)生方面均顯示出幾乎相同的陽性染色，這說明BEAS-2B 細(xì)胞能像hMSC1細(xì)胞一樣能在誘導(dǎo)后表現(xiàn)出很強的骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化能力。

BEAS-2B可用于篩選化學(xué)和生物制劑誘導(dǎo)。

目前，BEAS-2B已被廣泛用于研究肺癌發(fā)生的細(xì)胞和分子機制，其中包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在肺癌和肺炎球菌感染中的作用等。此外，BEAS-2B細(xì)胞系已被用作體外細(xì)胞模型，用于檢測和篩選具有潛在肺毒性或肺部致癌性的各種化學(xué)和生物制劑。

3.使用CRISPR-U?在BEAS-2B細(xì)胞中實現(xiàn)基因編輯

基因編輯和細(xì)胞模型的建立對于推進功能基因組學(xué)、信號通路、新陳代謝、細(xì)胞死亡、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物反應(yīng)和癌癥研究等領(lǐng)域具有重要的意義。BEAS-2B細(xì)胞作為研究藥物代謝活化作用和呼吸系統(tǒng)腫瘤以及分子機制的理想細(xì)胞模型，已經(jīng)有許多研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對其進行編輯以研究癌癥特征、耐藥機制的披露、癌癥治療、細(xì)胞死亡研究、功能基因組學(xué)、信號通路、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物反應(yīng)和細(xì)胞治療等多種具有重要意義的課題。源井生物研發(fā)的CRISPR-U?（基于CRISPR/Cas9技術(shù)）在DNA雙鏈的切割上比一般的CRISPR/Cas9系統(tǒng)更有效率，不僅可以顯著提高同源重組的效率，還能同時在體內(nèi)外實現(xiàn)高效的基因編輯，對于BEAS-2B細(xì)胞的基因編輯實驗有著極大的優(yōu)勢。

圖1 使用CRISPR-U?在BEAS-2B細(xì)胞中基因編輯過程

3.1 ?CRISPR-U?基因敲除BEAS-2B細(xì)胞系

通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或核轉(zhuǎn)移將gRNA和Cas9轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，然后通過藥物篩查后，產(chǎn)生單克隆，最終陽性克隆將通過測序進行驗證。具體案例如下：

圖2 ?BEAS-2B細(xì)胞系的敲除策略

P53基因是氡照射致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的重要影響因素。在人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）中敲除P53基因，并對基因敲除后的BEAS-2B細(xì)胞和正常BEAS-2B細(xì)胞分別進行氡染毒處理。研究人員發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細(xì)胞敲除P53基因后氡照射的BEAS-2B細(xì)胞更早地出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化。相較于BEAS-2B細(xì)胞染氡組(2B-Rn)，P53基因敲除的BEAS-2B細(xì)胞染氡組(P53 KO-Rn)增殖速度更快（P<0.05），形成克隆的時間更早（P<0.05），侵襲力更強（P<0.05），上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平變化也更早（P<0.05）。結(jié)果表明，氡照射導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并且P53在氡氣致肺癌中具有重要作用。

參考：http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201910-45.

3.2 ?基因敲入或基因點突變BEAS-2B細(xì)胞系

BEAS-2B細(xì)胞通過電穿孔法與gRNA、Cas9和Donor載體或Oligo共轉(zhuǎn)染，然后挑單克隆。陽性克隆將通過測序進行驗證。具體案例如下：

圖3 BEAS-2B細(xì)胞系的敲入策略

圖4 BEAS-2B細(xì)胞系的點突變策略

（1）點突變案例-1

為了研究突變體NRASQ61K在血管再生中的特異性影響，在正常（非腫瘤）人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中進行了敲入。與野生型(WT)細(xì)胞相比，在CAM上生長的NRASQ61K過表達(dá)細(xì)胞的特征是血管系統(tǒng)紊亂，并存在若干個出血區(qū)域。為了證實體內(nèi)NRASQ61K的促血管生成作用，在裸鼠身上進行了Matrigel plug試驗，結(jié)果如圖5B中所示，NRASQ61K表達(dá)細(xì)胞顯示出血管再生明顯增加，呈亮紅色。然而，野生型細(xì)胞中的血管再生可以忽略不計，并且血紅蛋白水平較低。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)NRASQ61K在體外的表達(dá)顯著增加了類毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)，如圖5C所示。而腫瘤血管生成的關(guān)鍵所在正是細(xì)胞在骨髓上自發(fā)形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，因此，NRASQ61K的表達(dá)會在一定程度上促進腫瘤血管的生成。

圖5 將NRASQ61K敲入BEAS-2B細(xì)胞

（2）點突變案例-2

COX-2基因啟動子區(qū)域包含NFκB、AP-1和NFAT結(jié)合位點，它們可以被這些轉(zhuǎn)錄因子識別，進而導(dǎo)致COX-2的轉(zhuǎn)錄。為了確定NFAT是否通過直接結(jié)合COX-2啟動子區(qū)域來調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)，研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，對COX-2-Luc啟動子區(qū)域的兩個NFAT結(jié)合位點進行了點突變。結(jié)果表明，這種突變導(dǎo)致亞砷酸鹽暴露誘導(dǎo)的COX-2轉(zhuǎn)錄受損。并且研究人員發(fā)現(xiàn)，與COX-2誘導(dǎo)相比，亞砷酸鹽在研究中的NFAT激活達(dá)到了更早的峰值。因為亞砷酸鹽的暴露只會導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞中的NFAT的激活，而不是AP-1和NFκB的激活，所以亞砷酸鹽激活NFAT是BEAS-2B細(xì)胞中COX-2誘導(dǎo)的原因。

另外為了證實NFAT3 在 BEAS-2B 細(xì)胞中亞砷酸鹽誘導(dǎo)的 COX-2 表達(dá)中的重要作用，研究人員構(gòu)建并使用了siNFAT3，他們將細(xì)胞用10μm NFAT 選擇性抑制劑預(yù)處理，然后暴露于20μm亞砷酸鹽中，研究人員發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細(xì)胞中siNFAT3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞中NFAT3蛋白表達(dá)的明顯降低(圖. 6 中b)。siNFAT3對NFAT3表達(dá)的特異性抑制阻斷了亞砷酸鹽誘導(dǎo)的COX-2轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)(圖. 6 中e和h）。

這些結(jié)果表明了，NFAT3是BEAS-2B細(xì)胞中亞砷酸鹽誘導(dǎo)COX-2的主要介質(zhì)。

圖6 ?BEAS-2B細(xì)胞系的點突變案例

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