如何設(shè)計(jì) QPCR 的引物
什么是 QPCR
QPCR 是一種允許實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物的 PCR。 通過(guò)在每個(gè)步驟中對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，熒光染料可用于定量 PCR 產(chǎn)物。 在 QPCR 分析中可以使用兩種熒光標(biāo)記方法。 它們是使用熒光染料和熒光標(biāo)記的探針。 熒光染料與 PCR 產(chǎn)物結(jié)合，而探針與 PCR 產(chǎn)物退火形成穩(wěn)定的三鏈 DNA。 QPCCR 中廣泛使用的熒光染料是 SYBR Green，而探針可以是 Taqman。 在 QPCR 期間使用探針檢測(cè) PCR 產(chǎn)物可提供更準(zhǔn)確的結(jié)果并提高測(cè)定的靈敏度。
圖 1：QPCR 的機(jī)制
如何設(shè)計(jì) QPCR 的引物
QPCR 引物的設(shè)計(jì)對(duì)于提高檢測(cè)的可靠性、準(zhǔn)確性和靈敏度至關(guān)重要。 QPCR 引物設(shè)計(jì)指南如下所述。
PCR 產(chǎn)物/擴(kuò)增子大小——PCR 產(chǎn)物的大小應(yīng)為 50-210 個(gè)堿基對(duì)。
引物長(zhǎng)度——引物的長(zhǎng)度應(yīng)為 19-23 個(gè)核苷酸。
GC含量——引物的GC含量應(yīng)為35-65%。
熔解溫度 (Tm) – 引物的熔解溫度應(yīng)為 60-68 °C。該測(cè)定的退火溫度比引物的 Tm 低 5°C。
外顯子-外顯子連接——當(dāng)通過(guò) QPCR 擴(kuò)增 cDNA 時(shí)，引物應(yīng)跨越外顯子-外顯子連接以避免污染 DNA 的擴(kuò)增。
重復(fù)和運(yùn)行 – 應(yīng)避免二核苷酸重復(fù) (TCTCTCTCTC) 和重復(fù)核苷酸（例如 TAAAAAAAGC）。
3' 互補(bǔ)性——應(yīng)避免正向和反向引物 3' 末端的互補(bǔ)區(qū)域，以防止形成引物二聚體。
3' 穩(wěn)定性 – G 或 C 殘基應(yīng)包含在引物的 3' 末端以增加退火的穩(wěn)定性。
GC 夾——引物 5' 端的一個(gè)或兩個(gè) GC 夾增加了退火的特異性。
特異性——引物的特異性應(yīng)通過(guò) BLAST 檢查
SNP——引物不應(yīng)包含任何已知的 SNP（單核苷酸多態(tài)性）變異
在 QPCR 的引物設(shè)計(jì)中可以使用多種在線工具，例如 Primer3、Primer-BLAST、IDT PrimerQuest、Primer Bank 和 OAT。
圖 2：引物二聚體的形成
引物的設(shè)計(jì)應(yīng)避免在 QPCR 中形成引物二聚體。 使用熒光染料檢測(cè) PCR 產(chǎn)物時(shí)至關(guān)重要，因?yàn)檫@些染料也會(huì)與引物二聚體結(jié)合以產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
結(jié)論
QPCR 用于 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)和定量。 引物的設(shè)計(jì)在 QPCR 中對(duì)于提高結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。 因此，在設(shè)計(jì) QPCR 引物時(shí)仔細(xì)遵循指南非常重要。
