●?研究背景

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)作為一種常見的B型毛孢霉菌毒素，因其高污染水平和生長(zhǎng)遲緩、體重減輕、厭食和神經(jīng)內(nèi)分泌變化等一系列毒性作用而受到廣泛關(guān)注。成肌細(xì)胞分化為肌管是肌肉發(fā)育的一個(gè)基本過程，細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-整合素受體相互作用與成肌細(xì)胞分化密切相關(guān)。DON在谷物儲(chǔ)存和加工過程中保持相對(duì)穩(wěn)定，使其能夠在人類和動(dòng)物的食物中持續(xù)存在，已有研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物肌肉中檢測(cè)到DON，提示DON有可能會(huì)影響肌肉的發(fā)育。但有關(guān)DON對(duì)肌肉毒性的研究較少，其分子機(jī)制尚不清楚。

●?研究思路

● 組學(xué)研究結(jié)果

1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析

作者通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析暴露于DON的C2C12細(xì)胞的差異基因（DEG）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定了2387個(gè)DEG，其中72%被下調(diào)。蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出402個(gè)DEG，其中74%被下調(diào)。GO和KEGG通路富集分析表明，轉(zhuǎn)錄組學(xué)DEGs參與了“男性主要性征的發(fā)育”、“骨骼肌肌球蛋白粗絲組裝”和“骨骼肌收縮的調(diào)節(jié)”等生物學(xué)過程。最富集的通路是“ECM-受體相互作用”、“人乳頭瘤病毒感染”和“蛋白質(zhì)消化吸收”。蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，富集到了“肌肉收縮”、“中間絲解聚”和“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)”等生物學(xué)過程。細(xì)胞成分中富集到“細(xì)胞骨架”、“細(xì)胞外基質(zhì)”和“整合素”。KEGG通路富集到“新霉素、卡那霉素和慶大霉素生物合成”、“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”、“ECM-受體相互作用”和“蛋白質(zhì)消化和吸收”。前兩條通路與上調(diào)的DEG相關(guān)，而后兩條通路與下調(diào)的DEG相關(guān)，這與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致。

2.差異基因的整合分析

為了更好地了解DON對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的整合分析。共鑒定了149個(gè)共同的顯著差異基因（co-DEG），其中91%被共下調(diào)（圖3A）。15%的co-DEG屬于真核細(xì)胞骨架，其中大部分屬于肌動(dòng)蛋白絲，少數(shù)是中間絲和微管的成分。對(duì)co-DEG進(jìn)行GO分析，生物學(xué)過程富集了“骨骼肌肌球蛋白粗絲組裝”和“快肌纖維收縮的正向調(diào)節(jié)”條目。細(xì)胞組分中富集的前五個(gè)條目是“纖維蛋白原復(fù)合物”、“細(xì)胞外空間”、“細(xì)胞外基質(zhì)”、“細(xì)胞外區(qū)域”和“蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)”，這些都是細(xì)胞外成分（圖3B）。結(jié)果表明，DON主要影響肌肉成分的組成和功能以及多種細(xì)胞外成分的表達(dá)。通路富集分析富集到了“ECM-受體相互作用”、“蛋白質(zhì)消化和吸收”、“人乳頭瘤病毒感染”和“粘著斑”等通路（圖3C）。

圖3?| 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的整合分析

3.DON下調(diào)各種細(xì)胞骨架基因的表達(dá)

由于成肌細(xì)胞分化取決于細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)，作者進(jìn)行了RT-qPCR以檢測(cè)各種骨骼肌相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白的基因表達(dá)。如圖4A所示，當(dāng)細(xì)胞用1μM DON處理時(shí)，肌動(dòng)蛋白α(actn3)和肌鈣蛋白的表達(dá)顯著降低。Acta1、肌球蛋白重鏈、mylpf、nes、myot、tmsb4x和vim響應(yīng)于較低濃度的DON顯著降低。與骨骼無關(guān)的細(xì)胞骨架基因，如acta2和β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)沒有顯著差異。在這些下調(diào)基因中，除acta1（屬于肌動(dòng)蛋白）、nes和vim（屬于中間絲）外，所有基因均屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，表明DON影響細(xì)胞骨架組成，主要作用于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。下一步檢測(cè)TNNT1、TNNC1、MLC2、ACTA2和β-ACTIN的蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，TNNT1、TNNC1和MLC2的表達(dá)在1μM DON下顯著降低（圖4B-C），而ACTA2和β-ACTIN的表達(dá)沒有顯著變化（圖4D-E），這與RT-qPCR結(jié)果一致。

圖4?| 細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)

●?研究結(jié)論

通過了解DON對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響，有助于食品和飼料污染的防治。本文研究表明，即使在安全濃度范圍內(nèi)，DON也會(huì)影響成肌細(xì)胞的分化，并提供了可能的分子機(jī)制（圖7）。DON抑制C2C12細(xì)胞的分化，其機(jī)制涉及細(xì)胞活力、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)和ECM-integrin-FAK-RAC-PAK信號(hào)通路的下調(diào)。了解DON對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響，有助于食品和飼料污染的防治。

圖7?| DON處理后成肌細(xì)胞分化的過程和信號(hào)通路

2、基因、轉(zhuǎn)錄+代謝探究酒酒球菌突變體對(duì)酸性環(huán)境響應(yīng)的綜合調(diào)控機(jī)制研究

2021年9月，西北農(nóng)林科技大學(xué)劉樹文課題組在《Food Microbiology》（IF:5.516）發(fā)表了題為的研究成果，通過全基因組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，代謝組學(xué)等多組學(xué)分析，研究了來自3個(gè)野生型菌株的6個(gè)酒酒球菌突變體對(duì)酸性環(huán)境響應(yīng)的綜合調(diào)控機(jī)制，揭示了酒酒球菌在高AS生長(zhǎng)期間的整體行為變化。

●?研究背景

乳酸菌LAB是一類常見微生物，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品和醫(yī)學(xué)，也是生化、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的理想遺傳材料。酒酒球菌是從葡萄中分離出來的菌類，是觸發(fā)葡萄酒發(fā)酵中蘋果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)的主要微生物。

環(huán)境脅迫會(huì)影響酒酒球菌的生長(zhǎng)，其中酸脅迫會(huì)導(dǎo)致酒酒球菌膜流動(dòng)性降低，激活H+-ATP酶活性，加速蘋果酸和檸檬酸鹽利用率。LAB對(duì)AS的耐受性受到多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，在整個(gè)生長(zhǎng)期調(diào)控AS反應(yīng)的全部機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

● 組學(xué)研究結(jié)果

1.?基因型與表型之間的關(guān)系

pH=3.0孵育120h后，b1、a3和c1（耐酸突變體）的細(xì)胞密度顯著高于相應(yīng)的野生型菌株SX-1b、SX-1a和CS-1b。與相應(yīng)的野生型菌株和耐酸突變體相比，b2和SX-1b的細(xì)胞密度最低。

來自同一野生型菌株的耐酸突變體b1和酸敏感突變體b2表現(xiàn)出最明顯的表型差異。

圖1 | pH=3.0 ATB培養(yǎng)基條件下酒酒球菌野生型及突變體的生長(zhǎng)活性

全基因組測(cè)序在6個(gè)突變體的459個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了1411個(gè)SNPs。富集分析顯示，這些SNPs在嘌呤代謝、嘧啶代謝、脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、藥物代謝和代謝途徑方面的檢出率存在顯著差異。統(tǒng)計(jì)分析表明，相同表型的突變體（耐酸突變體）中存在耐酸敏感的相同位點(diǎn)，表明SNPs與其表型密切相關(guān)。

圖2 | 不同采樣點(diǎn)的b1和b2之間DEGs(A)和差異代謝物(B)的總數(shù)變化

2.突變體的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析

對(duì)耐酸突變體b1和酸敏感突變體b2分別在3h、36h和108h進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，兩兩比較共檢測(cè)到550個(gè)DEG。圖3顯示了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)2種突變體的表達(dá)差異，結(jié)果表明，在不同的生長(zhǎng)階段，酒酒球菌對(duì)酸性環(huán)境的響應(yīng)是不同的。

圖3 | 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的富集分析結(jié)果

在代謝組學(xué)方面，三個(gè)采樣點(diǎn)(b1 vs b2)共積累了446種代謝物，各采樣點(diǎn)上調(diào)代謝物數(shù)量均高于下調(diào)代謝物數(shù)量。結(jié)果表明，在不同的生長(zhǎng)階段，酒酒球菌對(duì)酸性環(huán)境的響應(yīng)是不同的。

3.突變體基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的綜合分析

多組學(xué)整合分析對(duì)于增強(qiáng)對(duì)酸應(yīng)激反應(yīng)的理解和識(shí)別有意義的分子機(jī)制集群至關(guān)重要。篩選了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的整合途徑，以研究多種改變?nèi)绾喂餐龠M(jìn)酒酒球菌的酸調(diào)節(jié)。

圖4 | ?多組分析的綜合途徑

1）黃色連接線代表基因內(nèi) SNP；

2）彩色圓圈代表基因內(nèi) SNP 的基因表達(dá)水平（紅色，上調(diào)；綠色，下調(diào)；白色，無變化）；

3）橙色框表示 b1 和 b2 突變體之間代謝物的顯著差異；

4）藍(lán)框框?yàn)闄z測(cè)到的代謝物無顯著差異；

5）顏色矩形是三個(gè)生長(zhǎng)階段代謝物的相對(duì)含量變化（紅色，含量較高；

6）綠色，含量較低；白色，無顯著變化）。

●?研究結(jié)論

本文運(yùn)用了（基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，代謝組學(xué)）的多組學(xué)整合分析表明，酸敏感和耐酸O.oeni突變體的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)存在顯著差異，細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)基因和差異代謝物的水平在不同生長(zhǎng)階段也有變化。酒酒球菌突變體對(duì)酸性環(huán)境響應(yīng)的綜合調(diào)控機(jī)制，揭示了酒酒球菌在高AS生長(zhǎng)期間的整體行為變化。

隨著組學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，加快了組學(xué)研究向定量化，高通量的方向發(fā)展，通過對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析，已成為科學(xué)家探索生命機(jī)制的新方向。

本篇通過2篇微生物在食品研究中的應(yīng)用~

思路一：通過（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)）的多組學(xué)整合分析表明基因突變體的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)存在顯著差異，研究微生物在酸性環(huán)境響應(yīng)的綜合調(diào)控機(jī)制。

思路二：通過微生物毒素的研究探究嘔吐毒素的生長(zhǎng)發(fā)育。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)方法探究嘔吐毒素影響肌肉的發(fā)育和功能是一種具有創(chuàng)新性的研究文章。

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