前面小編介紹了正確查找、確定miRNA成熟體序列的方法。在miRNA的研究中免不了要檢測目標(biāo)miRNA的表達(dá)情況，但眾所周知miRNA成熟體的長度僅20~25個核苷酸，常規(guī)qPCR引物設(shè)計方法不適于miRNA的qPCR檢測，那么miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和qPCR引物設(shè)計應(yīng)該如何進(jìn)行呢？

下面漢恒生物小編就為大家介紹一下目前常用的兩種方法：莖環(huán)法和加尾法，兩種方法的原理都是通過在逆轉(zhuǎn)錄時增加逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度，經(jīng)上述兩種方法處理后，得到的cDNA長度可從原始的20nt增加到80nt以上，這樣即可實(shí)現(xiàn)miRNA的qPCR擴(kuò)增。

莖環(huán)法

莖環(huán)法需要設(shè)計3個引物：逆轉(zhuǎn)錄引物以及用于qPCR的一對檢測引物

逆轉(zhuǎn)錄引物：

通用的莖環(huán)序列+5~8個與目的miRNA的3'端反向互補(bǔ)的堿基。通用的莖環(huán)序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

以hsa-miR-378a-3p（MIMAT0000732）為例，該成熟體序列為：

ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC（3'端6堿基）

3'端6堿基反向互補(bǔ)序列：GCCTTC

hsa-miR-378a-3p的莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)引物則為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCTTC

作用原理：莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA 分子的3'端結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，獲得人為加長的 miRNA 第一鏈 cDNA。

qPCR檢測引物：

正向引物F：根據(jù)miRNA的序列設(shè)計，一般是用除去3'端6個堿基的剩余部分作為正向引物，若GC含量較低，可在5'端增加G/C進(jìn)行調(diào)整，使引物Tm值接近60℃。

反向引物R：為通用引物，一般選取莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的一部分，常用序列：GTGCAGGGTCCGAGGT 或ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG

hsa-miR-378a-3p的qPCR檢測引物：

F：GACTGGACTTGGAGTCA（設(shè)計出Tm值偏小，故在5'端加一個G）

R：GTGCAGGGTCCGAGGT

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加尾法

加尾法由兩個酶共同作用完成：PolyA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。PolyA聚合酶負(fù)責(zé)給miRNA加上PolyA尾，增加其長度。之后逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到PolyA序列上，由逆轉(zhuǎn)錄酶完成加長版cDNA的合成。其過程如下：

加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物：

3'端存在1-2個錨定堿基的Oligo dT（miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶），錨定堿基可特異性地結(jié)合到miRNA上，從而讓逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。

加尾法qPCR檢測引物：

miRNA熒光定量PCR的過程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端均為通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R，試劑盒自帶)。

正向引物則可將成熟miRNA的序列作為模板進(jìn)行設(shè)計（與莖環(huán)法類似）。

兩種方法如何選擇：

若檢測需要較高的靈敏性和特異性，可以考慮莖環(huán)法；另外，在檢測通量上，莖環(huán)法屬于特異性逆轉(zhuǎn)錄，一次逆轉(zhuǎn)錄只能檢測一個miRNA；加尾法可對抽提純化的miRNA進(jìn)行無差別，屬于高通量逆轉(zhuǎn)錄，一次逆轉(zhuǎn)錄可檢測多種miRNA。另外miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄是無法使用普通的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的，因?yàn)槠溥^程需要PolyA聚合酶。但莖環(huán)法可使用常規(guī)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，但是需要注意的是，逆轉(zhuǎn)錄引物要使用特異的莖環(huán)引物，而不是試劑盒中的隨機(jī)引物和Oligo dT引物。?

以上即為兩種miRNA的qPCR檢測方法，如果有其他的疑問，歡迎咨詢漢恒生物！