上期發(fā)了漫談組化的第一期，今天發(fā)第二期，繼續(xù)聊聊免疫組化那些事兒。

脫蠟復水

為什么脫蠟

• 這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。

修復

修復

• 由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。

• 常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。

• 常用修復液：檸檬酸鹽修復液(pH值6.0)、EDTA修復液(pH值8.0~9.0)、EGTA修復液(pH值9.0)和Tis修復液(pH值10.0)?？乖迯涂傮w來說PH值越高，修復能力越強；修復不足可能出現(xiàn)假陰性，過度修復會帶來背景過深的問題，所以不同組織的修復液選擇很重要。

• 我們實驗室用微波修復中火8min停火8min轉中小火7min，效果不錯。注意微波修復后自然冷卻，不然可能會出現(xiàn)背景色。

滅活

滅活內源性過氧化物酶和生物素

• HRP標記或生物素標記的二抗在做免疫組化時，容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。

• 內源性的過氧化物酶一般用3%的雙氧水封閉10-20min，時間不宜太久，久了容易脫片。

• 實踐證明以甲醇溶液配制3%過氧化氫效果更好，可能好在保護抗原和固定組織作用。

• 在含有豐富的內源性過氧化物酶的組織如肝腎骨髓、胎盤、脾等，由于血細胞中存在大量具有活性的過氧化物酶，這些組織染色可以增加過氧化氫的濃度和孵育的時間，也可以采用堿磷酶標記的方法如APAAP、LSAB等，可以避免過氧化物酶的干擾，提高陽性結果的特異性。

封閉

封閉

• 組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性；

• 封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

• 有條件的就用血清封閉，效果肯定優(yōu)于BSA，沒條件的用3%BSA封閉也可以。

• 一般室溫 10-30min。但也要防止封閉過度，容易造成假陰性。

一抗孵育

關于孵育溫度、時間

• 一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、37 度，建議一抗反應在 4 度最佳，低溫長時間的反應，結合的最牢固，但時間最好超過 16~24h。

• 4°過夜孵育后從冰箱拿出來復溫，20-50分鐘左右。目的是使抗原抗體結合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 度和 37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

抗體稀釋液和PBS有啥區(qū)別

• 體稀釋液一般用 PBS 即可，但專用的抗體稀釋液中除 PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA 穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。

• 稀釋液的PH值不宜偏酸，會導致背景一片黃（未見特異性染色），建議PH 在 7.4-7.6 濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

二抗孵育

二抗孵育

• 二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，我們實驗室是室溫50min，冬天適當增加時長。

• 熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能會有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。

• 二抗種屬選擇

• 二抗種屬應與一抗種屬相對應，例如：如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗 ，如山羊抗小鼠。

DAB顯色

DAB

• 背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由 DAB 孵育條件決定。DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；

• DAB 顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；

• 若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

• DAB 顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4 度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。

染核

染核

• 目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用蘇木素復染，注意蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當時間長一點，而胞核蛋白則要短。

• 不過這個如果染色不理想可以補救的。方法是：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返藍。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍即可。

• 注意蘇木素長時間接觸空氣會過度氧化，進而失去染色能力，如果出現(xiàn)這種情況，可以更換新的蘇木素。

脫水封片

脫水封片

• 脫水目的是為了切片能夠長期保存，過二甲苯能夠使切片透光率增加，切片變得透明，拍出來的效果更好。

• 如果切片從乙醇拿出入二甲苯出現(xiàn)乳白色沉淀，是因為脫水不徹底，水不溶于二甲苯導致的。解決辦法是更換新的脫水乙醇，從乙醇拿出來后風扇稍微吹干點再入二甲苯。

• 二甲苯脫水的一般用中性樹膠等封片，避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片膠，然后一手拿住蓋片某一端，接近封片膠近端先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一端，這樣一般不會產生氣泡。如果有氣泡，可以按壓擠一擠。

拍照、掃描

• 拍照倍數(shù)

• 一般200x即可，但可以低倍套高倍，一張100x一張400x

• 全景掃描

• 注意選擇景深擴展，至少3層，不然會因為焦距不一樣，局部會模糊。

其他情況

免疫組化實驗中的陽性對照和陰性對照。

• 陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；是排除方法和實驗系統(tǒng)有無問題；陽性對照做出來了，說明實驗步驟和操作是沒有問題的。

• 陰性對照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗來進行反應，其余步驟均一致。是排除有無一抗外的非特異性染色。

• 陰性對照一定是不會出來陽性結果的，如果陰性對照出來了陽性結果，那一定是非特異性背景染色。

切片清洗緩沖液

• 為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，我們實驗室3次每次5min搖床浸洗。

• 注意：①單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；
  

產生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？

• 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋 抗體來控制。這是最重要的一條

• 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

• 內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過 延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

• 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加 濃度來加強封閉效果；

• DAB 孵育時間過長或濃度過高；

• PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤為重要；

• 標本染色過程中經常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。

免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些？

• 抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結 合；建議微波修復用高火 4 次*6min 試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行，還 可高壓修復。

• 抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產的工作液，怎么這 么高稀釋度也沒能做出陽性結果？另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結果，抗原抗體反應 有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。
  

• 組織切片本身這種抗原含量低；

• 血清封閉時間過長。

• DAB 孵育時間過短。

• 細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

• 開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

單克隆抗體和多克隆抗體

• pAb：**polyclonal antibody 多克隆抗體

• mAb：**monoclonal antibody 單克隆抗體

• 抗體是由B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的。每一個B淋巴細胞在成熟的過程中通過隨機重排只產生識別一個抗原的抗原受體基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。

• 單克隆抗體：是指由識別某一個抗原決定簇的漿細胞經過克隆后產生的抗體。

• 多克隆抗體：是指有識別多個抗原決定簇的漿細胞經過克隆后產生的抗體。

• 因此，單克隆抗體特異性高，靈敏度差；多克隆抗體特異性低，靈敏度高。

免疫組化結果如何分析？

• （1）陽性著色細胞計數(shù)法。在 40*光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數(shù)陽性 著色細胞，每組 3~6 張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。

• （2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imag e j進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。

• （3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3 分為陰性著色、淡黃色、 淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4 分為 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%）， 最終可以分數(shù)相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、 背景很淺的高質量切片。

• 詳情可見之前發(fā)的一篇推文。
  IHC（免疫組化）結果分析
  

腦組織如何防脫片？

• 腦組織的構成元素主要為膠質細胞，通過神經元連接而成，腦組織細胞中水分和脂質含量較高，在修復過程中會發(fā)生脫片碎片。

• 首先需要固定充分，固定前把腦子切成幾片再固定。

• 其次從水中撈出后不要急于平烤，先將水瀝干（直立放在切片架上）2小時左右，然后平放于烤片臺上烤1時以上。（溫度75）。

• 最后修復液可以選擇溫和的檸檬酸鈉6.0來修復，過程中不要對著組織直接沖洗。
  

常見封片膠

• 中性樹膠，以二甲苯為溶劑，常用來封二甲苯脫水的片子，優(yōu)點是透明度高，不容易長霉，缺點是二甲苯味兒大。需要特別注意的是，沒脫水的片子不要中性樹膠封片，二甲苯不溶于水，會生成白色沉淀，影響閱片和掃描。

• 水溶性封片膠，最常用的就是甘油明膠，用于免疫熒光等未脫水組織的封片，甘油明膠低溫呈固態(tài)，

• 用之前提前37-50°預熱融化。

• 抗熒光衰減封片劑，以甘油為基礎，加入抗熒光衰減劑，有強烈的 抗熒光衰減作用，用于對熒光組織和細胞樣品的封片。缺點是不容易干，蓋玻片容易滑動，鏡下觀察倒還好，全景掃描很受影響。

• 解決辦法是擦干或風扇吹干多余水分后，100ul槍頭滴一滴水溶性封片劑，再用10ul槍頭在組織外四周點4點中性樹膠，用于固定蓋玻片。
  

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