“阿嚏！”又是一年花粉季，很多小伙伴會面臨花粉過敏的困擾。服用抗過敏藥之后，過敏癥狀得到緩解，但卻會感到昏昏欲睡。這是為什么呢？原來抗過敏藥物中含有抗組胺成分。當抗組胺藥通過血腦屏障進入大腦，阻斷中樞組胺受體，就會引起嗜睡。那么，組胺是什么？阻斷中樞的組胺受體又為何會引起嗜睡呢？

組胺（Histamine，HA）是一種重要的單胺類信號分子，存在于中樞神經系統(tǒng)和外周組織，廣泛參與免疫、消化和神經信號的調控?？菇M胺藥物常被用來緩解過敏反應，但是抗組胺藥物的一大副作用是嗜睡，這引起科學家關注組胺在中樞系統(tǒng)中的功能。

在大腦中，組胺能神經元的胞體主要分布于下丘腦結節(jié)乳頭體核（Tuberomammillary nucleus, TMN），其神經纖維向全腦廣泛投射。組胺能信號參與調節(jié)睡眠覺醒、學習記憶和攝食等重要生理學過程，但其分子調控機制尚不清楚。因此，為了揭示組胺對睡眠覺醒等生理學過程的分子調控機理，我們急需發(fā)展靈敏、特異，可對組胺進行高時空分辨率監(jiān)測的有效工具。

2023年3月15日，北京大學李毓龍實驗室在Neuron 雜志在線發(fā)表了題為Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo的研究論文，報道了新型基因編碼的組胺探針GRABHA的開發(fā)，以及結合新工具對睡眠覺醒過程中的組胺動態(tài)調控的研究。

在這項工作中，李毓龍實驗室首先靈活運用GRAB策略（GPCR-Activation Based Sensor）將循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpEGFP嫁接到四種人源組胺GPCR受體的第三個胞內環(huán)，發(fā)現(xiàn)基于H4R的探針表現(xiàn)出優(yōu)于其他受體的細胞膜定位特性，后續(xù)通過一系列優(yōu)化，獲得了基于H4R的組胺熒光探針GRABHA1h（簡稱HA1h）。在HEK293T細胞表達的HA1h探針對組胺有~370%的熒光信號響應（ΔF/F0）和~17 nM的親和力（EC50）（圖1）。為了進一步拓展探針對組胺濃度的檢測范圍，作者篩選了來自于不同物種的組胺受體，并開發(fā)了基于水熊蟲H1R的組胺熒光探針GRABHA1m（簡稱HA1m），HA1m探針對組胺的最大ΔF/F0 ~590%，EC50 ~380 nM。HA1h和HA1m探針能在亞秒級（~0.3-0.6 s）時間尺度上響應胞外組胺濃度變化，且不與GPCR下游胞內信號偶聯(lián)；進一步研究發(fā)現(xiàn)HA1h和HA1m探針只會響應組胺，而對組胺的前體、組胺代謝產物和其它神經遞質均不響應，并且組胺引發(fā)的信號能夠被相應受體的拮抗劑阻斷，這說明探針保留了相應受體的藥理學特性。

圖1：新型組胺探針的刻畫。

A, 組胺探針工作原理。B, 組胺探針HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T細胞上的表達及對組胺的反應。C, 組胺探針對飽和濃度組胺的響應曲線。D, 組胺探針HA1h和HA1m對不同濃度組胺的信號響應。

組胺探針是否能夠檢測內源組胺的釋放？作者借助AAV病毒將HA1m探針表達在小鼠的前額葉皮層（Prefrontal cortex, PFC），制備急性腦切片后使用雙光子成像成功地記錄到了電刺激引起的組胺秒級釋放。此外，作者還實時地觀察到組胺信號從刺激位置向外的擴散。因此，HA1m組胺探針可以實現(xiàn)對內源組胺釋放的高時空分辨率檢測。

組胺探針是否能夠應用于活體動物中？組胺是調控睡眠覺醒的重要分子，視前區(qū)（Preoptic area, POA）是參與睡眠覺醒調控重要的腦區(qū)，且接收組胺能神經元密集的投射。作者首先利用AAV病毒將HA1m探針表達在小鼠的視前區(qū)，通過光纖記錄探針的熒光信號，同時記錄小鼠腦電和肌電以判斷睡眠狀態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)在小鼠快速眼動（REM）睡眠向覺醒轉換和非快速眼動（NREM）睡眠向覺醒轉換過程中組胺信號升高，在覺醒向NREM睡眠轉換和NREM睡眠向REM睡眠轉換過程中組胺信號下降。

作為對照，利用突變失活型探針觀察不到明顯的信號變化，說明信號檢測的特異性。進一步的，作者在組胺合成酶敲除（HDC KO）的小鼠中發(fā)現(xiàn)HA1m探針信號也沒有明顯變化。綜上所述，HA1m探針能夠實現(xiàn)在活體小鼠中對組胺動態(tài)變化進行可靠、實時、特異的檢測。

圖2：不同核團組胺動態(tài)變化動力學在睡眠時相轉換過程中存在差異。

A, 探針表達和記錄示意圖。B, HA1h探針在PFC和POA的動態(tài)變化曲線。

組胺神經元胞體位于下丘腦結節(jié)乳頭體核，并向全腦發(fā)出廣泛投射。那么，組胺在不同腦區(qū)的動態(tài)變化模式是否一致？作者將HA1h探針表達在小鼠的視前區(qū)和前額葉皮層，同時記錄了這兩個腦區(qū)的組胺在睡眠覺醒中的動態(tài)變化（圖2）。結果發(fā)現(xiàn)，兩個腦區(qū)組胺探針信號大小在相同睡眠時相時是一致的。

有趣的是，在REM睡眠向覺醒轉換、NREM睡眠向覺醒轉換和覺醒向NREM睡眠轉換過程中，視前區(qū)的組胺變化動力學比前額葉皮層更快，這提示了組胺在不同腦區(qū)中存在不同的調控模式。總之，利用新開發(fā)的組胺探針，作者發(fā)現(xiàn)不同腦區(qū)的組胺動力學存在差異，為研究組胺的功能提供了重要的啟示。

在中樞神經系統(tǒng)中，除了本項工作研究的睡眠覺醒調控外，組胺還參與其它的生理和病理過程，包括攝食、運動、認知、癲癇和偏頭痛等。在外周系統(tǒng)中，組胺還參與過敏反應、瘙癢和胃酸分泌等過程。新型的組胺熒光探針將會成為探究組胺調控重要生理、病理過程分子機制的有力工具。

圖形摘要：組胺熒光探針GRABHA的工作原理及離體和在體應用。

北京大學生命科學學院博士后董輝和博士生李夢堯（已畢業(yè)）為本文共同第一作者，李毓龍教授為通訊作者，實驗室成員鄢羽岐、錢統(tǒng)瑞、林云致、劉燦、李國川和王歡對文章做出了重要貢獻。該工作得到了阿姆斯特丹自由大學（Vrije Universiteit Amsterdam） Rob Leurs教授及其團隊Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作，以及浙江中醫(yī)藥大學/浙江大學陳忠教授團隊和復旦大學中山醫(yī)院楊向東教授團隊的大力支持。該工作得到了北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、國家自然科學基金、北京市科委、生命醫(yī)學峰基金和宋晨楓與高欣欣公益基金會等機構、經費和項目的大力支持。

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http://yulonglilab.org/

此外，李毓龍實驗室誠聘不同學科背景的副研究員、博士后及技術員，待遇從優(yōu)。歡迎對腦科學感興趣的有志青年加入！

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.02.024

專家點評

黃志力 復旦大學教授，中國睡眠研究會理事長

第一代組胺H1受體阻斷藥易通過血腦屏障，最常見的副作用是嗜睡。但組胺H3受體拮抗劑負反饋增加組胺等覺醒相關遞質的釋放，已經被批準用來治療嗜睡癥。遺傳學和藥理學等證據(jù)表明中樞神經遞質組胺具有促覺醒作用，但是，組胺等覺醒遞質在腦內的動態(tài)變化模式、釋放模式有待理精細分析。早期微透析方法揭示這些覺醒遞質在覺醒時水平高，睡眠時降低。但由于微透析方法時間分辨率低，我們很難窺見這些覺醒遞質釋放的細節(jié)和差異。

北京大學李毓龍團隊通過GRAB策略開發(fā)了檢測胞外組胺的新型熒光探針，該探針靈敏度高，特異性強。利用新型組胺探針，他們進一步在小鼠睡眠覺醒相關核團研究了組胺在大腦不同時相中的動態(tài)變化。有趣的是，在小鼠視前區(qū)和前額葉皮層組胺的動態(tài)變化動力學存在差異，提示組胺在不同的核團功能可能存在差異。文章報道了兩種不同親和力的組胺探針，為檢測不同濃度下的組胺提供了更多選擇。李毓龍團隊開發(fā)的組胺探針為研究組胺生理、病理和藥理學作用和機制提供了強大的工具。
李毓龍團隊前期開發(fā)的一系列神經遞質熒光探針，為我們深入了解大腦中不同睡眠覺醒相關遞質和調質功能，破解大腦奧秘提供有力支撐。

胡志安 陸軍軍醫(yī)大學教授，陸軍軍醫(yī)大學腦與智能研究院執(zhí)行院長

1910年，英國科學家Dale及其同事報道了一種能夠刺激平滑肌收縮的物質，并命名為組胺。早期，組胺被認為主要參與炎性反應，抗組胺藥物也主要用于治療過敏性疾病。然而，在臨床應用中,抗組胺藥常被報道引起嗜睡等中樞神經系相關的不良反應?；诖司€索，科學家發(fā)現(xiàn)腦內下丘腦結節(jié)乳頭核（TMN）存在一群組胺能神經元，這些神經元在覺醒維持中扮演了重要角色。實際上，組胺的促覺醒作用具體體現(xiàn)為促進記憶、運動等腦的功能。我們實驗室長期關注組胺對記憶的調控。既往一系列工作發(fā)現(xiàn)組胺通過提高內嗅皮層谷氨酸能神經元興奮性，進而促進空間記憶獲得（Chao et al., Cerebral Cortex, 2016；Chen et al., Cerebral Cortex, 2018）。

組胺在覺醒睡眠周期動態(tài)變化規(guī)律如何？不同組胺水平如何調控不同腦功能活動？既往的研究手段主要為在體場電位記錄、鈣成像等，通過監(jiān)測組胺能神經元胞體功能活動間接反應組胺釋放水平。限于技術手段，難于弄清不同功能靶區(qū)內組胺的釋放情況及其動態(tài)變化規(guī)律。北京大學李毓龍教授團隊多年來致力于開發(fā)基于GPCR的新型神經遞質熒光探針，利用這些新型探針已經實現(xiàn)在體動態(tài)檢測多種神經遞質，包括乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、五羥色胺等動態(tài)變化。在最新出版的Neuron上，該團隊報告成功研發(fā)出新型組胺熒光探針。經過上千次的篩選和優(yōu)化，開發(fā)了具有反應速度快、高親和力、高特異性等特點的新型組胺熒光探針，成功實現(xiàn)在特定功能腦區(qū)內組胺的動態(tài)變化的檢測。更有意思的是，利用組胺熒光探針，該團隊發(fā)現(xiàn)視前區(qū)和前額葉皮層內組胺水平均是在覺醒期高于睡眠期。視前區(qū)和前額葉皮層內組胺水平變化呈現(xiàn)不同的動力學特性，睡眠轉覺醒過程中視前區(qū)組胺上升較比前額葉皮層快。
毫無疑問，新型組胺探針的開發(fā)為研究組胺如何調控不同腦功能活動提供了一大利器，將極大拓展我們對組胺發(fā)揮作用的機制認識。不僅如此，該項研究發(fā)現(xiàn)不同功能腦區(qū)內組胺的釋放具有不同的動力學特征，提示組胺神經元存在異質性，這可為后續(xù)進一步在單細胞水平解析組胺神經元結構功能提供重要線索。

需要繼續(xù)關注的是，前額葉皮層等功能腦區(qū)除了接受組胺能纖維支配外，還接受大量其它覺醒神經系統(tǒng)（如去甲腎上腺素，乙酰膽堿等）的纖維支配，回答不同促覺醒遞質如何釋放并協(xié)同工作的問題，是闡明覺醒系統(tǒng)工作原理的重大挑戰(zhàn)。我們期待李毓龍教授團隊開發(fā)出能同時監(jiān)測多種神經遞質釋放的技術，以期全面地窺探在不同腦功能狀態(tài)下各種促覺醒的神經遞質的釋放規(guī)律。

朱景寧 南京大學教授

組胺自1910年被發(fā)現(xiàn)以來，長期被認為作為一種外周局部激素發(fā)揮作用，參與調控胃腸道平滑肌收縮和免疫炎癥反應等。直至上世紀七十年代左右，組胺才在腦內被發(fā)現(xiàn)，并被確定為一種中樞神經遞質或神經調質。有意思的是，中樞組胺能神經系統(tǒng)在各物種間高度保守，人腦中的組胺能神經元約有64000個，全部聚集于下丘腦結節(jié)乳頭體核這一小小的核團，但它們發(fā)出的軸突幾乎支配了全腦。因此，組胺被認為發(fā)揮了“全腦功能的調節(jié)者”的作用，廣泛參與睡眠覺醒、攝食節(jié)律、運動控制、學習記憶和情緒獎賞等多種基本生理穩(wěn)態(tài)和高級功能的調控。已有四種組胺受體亞型（H1R-H4R）被相繼鑒定出來，它們均屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。值得注意的是，組胺受體家族是目前藥物開發(fā)投入產出比最高的受體家族之一，組胺能藥物已被廣泛應用于過敏、消化系統(tǒng)潰瘍以及前庭疾病的臨床治療。此外，研究表明中樞組胺能神經系統(tǒng)還與睡眠障礙、嗜睡-猝倒癥、Tourette綜合征、多發(fā)性硬化、帕金森病、癲癇和酒精成癮等密切相關。因此，闡明中樞組胺在各類生理功能和病理變化中的動態(tài)活動模式，對于深入認識中樞組胺能神經系統(tǒng)的腦功能調節(jié)機制，以及開發(fā)新型組胺能藥物具有重要意義。然而，高靈敏度且具備時空分辨率的組胺探查工具至今依然缺乏。

北京大學李毓龍教授領導的團隊是開發(fā)可遺傳編碼的檢測神經遞質/調質的熒光探針的國際頂尖團隊，其最新開發(fā)的基因編碼的基于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）激活的組胺探針可實現(xiàn)離體腦片和自由活動小鼠腦中細胞外組胺動力學的高時空分辨率監(jiān)測。他們發(fā)表在Neuron上的研究工作，首次報道了連續(xù)完整的睡眠-覺醒周期中組胺信號的動態(tài)活動規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了關鍵睡眠-覺醒調控中樞——視前區(qū)（POA）中的組胺信號在快速眼動（REM）睡眠向覺醒轉換，以及非快速眼動（NREM）睡眠向覺醒轉換的過程中均顯著升高，而在覺醒向NREM睡眠轉換和NREM睡眠向REM睡眠轉換的過程中顯著下降。特別是，該團隊對比分析了接受組胺能纖維密集投射，并在與覺醒狀態(tài)密切相關的執(zhí)行功能（如注意和抉擇）中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用的前額葉皮層（PFC）與POA中的組胺信號，驚喜地發(fā)現(xiàn)雖然這兩個腦區(qū)的組胺信號在睡眠-覺醒周期中表現(xiàn)出相似的變化趨勢，卻在REM/NREM睡眠向覺醒轉換，以及覺醒向NREM睡眠轉換過程中表現(xiàn)出截然不同的動力學特性，這為未來深入解析睡眠-覺醒與執(zhí)行功能間相互作用和協(xié)調整合的神經機制和編碼模式打開了新思路。

可以預見，高時空分辨率組胺探針的成功研發(fā)和不斷迭代將為精細刻畫中樞組胺在不同生理和病理過程中的動態(tài)變化提供有力的新工具，使得在高時空分辨率維度下重新解析中樞組胺能神經系統(tǒng)的活動規(guī)律成為可能，從而為全面認識中樞乃至外周組胺新功能，理解相關疾病發(fā)生發(fā)展新機制，以及研發(fā)干預治療新策略注入新的活力。

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標簽：腦科學神經科學