正文

斯克里普斯研究所的科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了一種具有大幅縮短現(xiàn)代疫苗開發(fā)流程潛力的方法，并展示了他們?nèi)绾螒?yīng)用高分辨率的冷凍電鏡（cryo-EM）數(shù)據(jù)來快速在原子水平上表征由疫苗或感染引起且與選定的病毒靶點(diǎn)相結(jié)合的抗體。該方法利用一種 "從結(jié)構(gòu)到序列"的計(jì)算機(jī)算法，可以將冷凍電鏡確定的單克隆抗體（mAb）結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)的DNA序列聯(lián)系起來。

該研究的通訊作者、斯克里普斯研究所的結(jié)構(gòu)和計(jì)算生物學(xué)系教授Andrew Ward博士提到："COVID-19的大流行突出了對(duì)高效快速的疫苗和抗病毒技術(shù)的需求。我們樂觀地認(rèn)為，這種新方法將通過極大縮短抗體的發(fā)現(xiàn)流程來幫助我們滿足這一需求。"

Andrew Ward和他的同事們?cè)凇?span id="s0sssss00s" class="color-default">Science Advances》上的?"從結(jié)構(gòu)到序列，基于冷凍電鏡的抗體發(fā)現(xiàn)"一文中描述了他們的技術(shù)。(DOI: 10.1126/sciadv.abk2039)

文章作者們指出，單克隆抗體的分離和定性是對(duì)疫苗或感染的免疫反應(yīng)分析中的一大痛點(diǎn)。"顯著降低傳統(tǒng)抗體分離方法效率的步驟之一是篩選mAb庫，以確定具有所需表位特異性的克隆......對(duì)感染或疫苗接種的免疫反應(yīng)進(jìn)行綜合分析是極其費(fèi)力且昂貴的。" 正如該研究的共同第一作者Aleksandar Antanasijevic博士所提到的："一般來說，識(shí)別對(duì)病毒有用的抗體需要對(duì)產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞進(jìn)行費(fèi)力的分類和測(cè)試，以找到正確的抗體。這一過程往往需要數(shù)月時(shí)間。"

研究人員的部分成果歸功于最近冷凍電鏡的改進(jìn)，這種技術(shù)使用電子束來標(biāo)記目標(biāo)并成像，其結(jié)果準(zhǔn)確度遠(yuǎn)高于普通光學(xué)顯微鏡。例如，在8月發(fā)表于《Nature Communications》上的一項(xiàng)研究中，研究人員使用高分辨率冷凍電鏡快速而精確地繪制了獼猴的抗體與HIV包膜蛋白的合成版本結(jié)合的位置，這些合成版本正在被開發(fā)并用于潛在的HIV疫苗。他們寫道："最近，我們開發(fā)了一種方法（cryoEMPEM），即使用冷凍電鏡（cryoEM）在免疫血清的水平上表征由疫苗接種或感染引起的多克隆抗體（pAb）反應(yīng)。

在研究中，研究者們將這一研究思路向前推進(jìn)了一步。他們采用了一種 "從結(jié)構(gòu)到序列"的計(jì)算機(jī)算法，該算法可以將冷凍電鏡確定的抗體結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生該結(jié)構(gòu)的DNA序列聯(lián)系起來。他們寫道："在這項(xiàng)研究中，我們通過引入一種從結(jié)構(gòu)觀察中識(shí)別功能性抗體序列的方法，擴(kuò)大了冷凍電鏡數(shù)據(jù)的適用性。"

為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，研究小組建立了一個(gè)含有獼猴的所有抗體編碼的DNA序列數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可以通過快速對(duì)動(dòng)物淋巴結(jié)中產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行批量測(cè)序而獲得。將該算法應(yīng)用于冷凍電鏡數(shù)據(jù)和抗體序列庫后，科學(xué)家們便能將冷凍電鏡圖像中的選定抗體與序列數(shù)據(jù)庫中定義的獨(dú)特抗體進(jìn)行高準(zhǔn)確度匹配。

研究小組表示，他們可以通過使用序列數(shù)據(jù)制作一個(gè)單克隆抗體的副本來確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并通過冷凍電鏡驗(yàn)證該抗體與最初成像的抗體以相同的方式結(jié)合。"......我們開發(fā)了一種直接從冷凍電鏡圖像中確定mAb序列的方法，"該團(tuán)隊(duì)說。"這種由電子顯微鏡（EM）和次世代測(cè)序（NGS）組成的復(fù)合方法使多克隆Fabs（Fv）可變區(qū)域的序列分配成為可能，包括互補(bǔ)性決定區(qū)域（CDRs）......這種方法為基于單個(gè)B細(xì)胞分選、雜交瘤和噬菌體展示技術(shù)的傳統(tǒng)mAb發(fā)現(xiàn)方法提供了一種替代方法。"

斯克里普斯研究所科學(xué)家和研究的共同第一作者Charles Bowman博士說。"有了這種新方法，我們只需10天左右便能從病人的血樣中采集到所有由感染及免疫引發(fā)的目標(biāo)抗體"

文章作者們還指出，在文中概念的驗(yàn)證過程中，他們使用了對(duì)某種特定抗原具有特異性的淋巴結(jié)B細(xì)胞。然而，他們推測(cè)這種方法也適用于從其他來源獲得的B細(xì)胞，如外周血、脾臟、骨髓或漿細(xì)胞，并且無需為抗原結(jié)合進(jìn)行預(yù)選。對(duì)此，他們表示："通過使用冷凍電鏡直接對(duì)血清抗體進(jìn)行成像的方法，我們有了豐度、親和力和克隆性的指標(biāo)。

科學(xué)家們現(xiàn)在正在完善他們的技術(shù)，以優(yōu)化其效率和可用性，以期將其應(yīng)用于以下幾個(gè)領(lǐng)域：快速評(píng)估人類對(duì)實(shí)驗(yàn)性HIV疫苗的抗體反應(yīng)；為自身免疫性疾病開發(fā)抗體阻斷療法；以及發(fā)現(xiàn)可以治療性地?fù)糁屑?xì)胞上其他蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的抗體。

研究者們預(yù)測(cè)：在未來，冷凍電鏡技術(shù)和"從結(jié)構(gòu)到序列"的算法改進(jìn)將允許我們更快速地識(shí)別抗體：只需依靠高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)圖像，而不需要對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行DNA測(cè)序。

Antanasijevic說："這種從結(jié)構(gòu)到序列的算法在免疫學(xué)和其他領(lǐng)域有很大的潛力。"我們?cè)O(shè)想有一天能夠用它來研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，例如，發(fā)現(xiàn)某個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合配體"。正如作者所總結(jié)的那樣，"......我們的方法將為發(fā)現(xiàn)毫安抗體和分析感染和疫苗接種的抗體反應(yīng)打開新的大門。目前的COVID-19大流行便突出了對(duì)這種高效且快速的技術(shù)的需求"。

支持性內(nèi)容

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在分析對(duì)疫苗或感染的免疫反應(yīng)時(shí)，其中一個(gè)限制性步驟是對(duì)單克隆抗體的分離和定性。在這里，我們提出了一種融合了結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法，直接分配重鏈和輕鏈，確定互補(bǔ)性決定的區(qū)域，并從血清衍生的多克隆抗體與抗原結(jié)合的低溫電鏡密度圖中發(fā)現(xiàn)序列。當(dāng)與下一代免疫測(cè)序相結(jié)合時(shí)，我們能夠特異性地識(shí)別克隆家族成員，合成單克隆抗體，并確認(rèn)它們與抗原的互動(dòng)方式與相應(yīng)的多克隆抗體相當(dāng)。這種從多克隆血清中鑒定單克隆抗體的基于結(jié)構(gòu)的方法為分析免疫反應(yīng)和迭代疫苗設(shè)計(jì)開辟了新途徑。

水木視界丨iss. 9

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