免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一種純化蛋白質(zhì)的方法。將目的蛋白的抗體與樣品提取液孵育，使抗體和蛋白質(zhì)在溶液中結(jié)合。然后用protein A/G 耦合的瓊脂糖凝膠，從樣品中將抗體/抗原復(fù)合物提取出來。這種物理方法可將所需蛋白質(zhì)從樣品中分離，然后樣品可以通過SDS-PAGE 進行分離并做 Western blot 分析。

IP流程

01

收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或4℃裂解30 min， 12 000g離心30 min后取上清；

02

取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1 μg 相應(yīng)的抗體和10~50 μl protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

03

免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3 000 g 速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1 ml 裂解緩沖液洗3~4次；最后加入15 μl 的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；

04

SDS-PAGE，Western blotting或進行質(zhì)譜分析。

實驗成功四大步

01蛋白樣品處理

免疫沉淀實驗成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。免疫沉淀實驗本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。

• 全程注意低溫操作：冰上或4℃

• 裂解液常用RIPA，主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度的NaCl，一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等

02抗體-agarose beads孵育

• 裂解細(xì)胞，用制備的細(xì)胞裂解液上清+抗體+Protein A/G beads進行孵育實驗
  

03抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外，去除免疫沉淀實驗非特異性的一個辦法是對抗體-agarose beads復(fù)合物進行多次洗滌。

一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實驗要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達到去除非特異性吸附的效果。

04鑒定

通常用于免疫沉淀的抗體量非常大（1ug），所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈時，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強而影響對目的蛋白的WB結(jié)果判斷。如何避免重/輕鏈的干擾？分享兩個小妙招：

1.? 選擇不同種屬的抗體作為免疫沉淀實驗和WB檢測的一抗，再選擇一個種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無種屬交叉反應(yīng)的二抗進行WB檢測，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。

2.? 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A/G beads交聯(lián)，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarose beads復(fù)合物，最后離心去除抗體-agarose beads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀實驗用途非常廣泛，基于最基本的免疫沉淀實驗又衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實驗手段，如免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀，它們之間的差異以及常見問題，小編會在后續(xù)文章中跟大家分享，愛我就請關(guān)注我~

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