【耀文解讀】mRNA篇︱poly A尾序列的設(shè)計與優(yōu)化
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前言
Poly A尾巴幾乎存在于所有的真核生物中，組蛋白是目前唯一已知的可以轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生末端不攜帶poly A尾巴的mRNA。在細胞核內(nèi)，mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生后，需要馬上經(jīng)過一系列加工處理完成末端修飾，此過程稱為RNA processing。mRNA轉(zhuǎn)錄后的修飾對于其從細胞核內(nèi)輸出到成功翻譯表達出蛋白的一系列過程來說是必需的。
此文先介紹了mRNA ploy A尾的形成機制、生理功能，然后針對mRNA poly A尾巴序列縮短、半衰期短等問題，結(jié)合文獻給出了相應的優(yōu)化方案。
細胞內(nèi)mRNA 3′末端poly A尾巴形成機制
幾乎所有真核生物mRNA 3'末端的修飾都是通過核酸內(nèi)切酶切割和添加poly A實現(xiàn)的。在哺乳動物細胞種，這種修飾反應依賴于切割位點上游的AAUAAA序列，切割位點下游的富含GU或者U的序列以及AAUAAA序列上游的刺激序列。在AAUAAA序列和下游富含U序列之間發(fā)生核酸內(nèi)切酶切割，從而產(chǎn)生一個末端含有3'OH的上游序列和一個末端含有5'磷酸基因的下游序列。上游序列末端發(fā)生聚腺苷酸化，添加上poly A尾巴，下游序列被降解掉（圖1）。因此，poly A尾巴并不存在于基因中，而是pre-mRNA 3'末端發(fā)生內(nèi)部切割后聚腺苷酸反應的終產(chǎn)物。在真核細胞中，尾巴長度的變動范圍可以從酵母中的90個腺苷酸到哺乳動物中大概250個腺苷酸[1]。
圖1 pre-mRNA 3'末端經(jīng)核酸內(nèi)切酶切割后發(fā)生聚腺苷酸反應生成poly A尾巴
mRNA poly A尾巴的生理功能
mRNA的多聚腺苷酸化為多種核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）提供了結(jié)合位點，如poly A結(jié)合蛋白（polyadenylate-binding protein，PABPC）。Poly A尾巴及其相關(guān)蛋白在胞質(zhì)中介導mRNA降解的同時保護細胞核中的mRNA不受酶的破壞。
圖2 mRNA閉環(huán)翻譯模型
Poly A尾巴除了在mRNA轉(zhuǎn)換中起作用外，在mRNA翻譯中也起著重要的作用。真核生物存在一個常見的翻譯模型：mRNA閉環(huán)翻譯模型（圖2），其認為真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）可以結(jié)合mRNA的5'端poly A尾，進而將mRNA形成閉環(huán)，結(jié)合多個核糖體，以提高效率。
mRNA poly A尾巴的設(shè)計
Poly A尾巴與PAPB結(jié)合，PAPB跟翻譯起始因子eIF4G相互作用，使得mRNA形成“閉環(huán)”結(jié)構(gòu)，有助于募集40S翻譯起始復合物到mRNA上，與5'末端帽子結(jié)構(gòu)協(xié)同作用，共同刺激翻譯起始。Poly A尾的長度顯著影響其與PABP的結(jié)合能力。
耀海生物設(shè)計的poly A尾分布均一，poly A尾一體化轉(zhuǎn)錄形成，分布更為均一。關(guān)于此方面的問題，大家可以文末查看菌菌的聯(lián)系方式。
關(guān)于poly A尾的設(shè)計主要有以下幾點：
1.??????哺乳動物的poly A尾平均長度約為200nt，其在酵母中平均約70nt；
2.??????Poly A尾長度并非恒定不變，poly A尾中也可以含有非A的核苷酸組分來抑制mRNA的衰變降解途徑；
3.??????Poly A尾長度、翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性之間并不是簡單的線性關(guān)系；
4.??????非洲爪蟾卵母細胞：32nt以上的poly A尾在翻譯效率上就等同于150nt長度的poly A尾，但當poly A尾長度不足16nt時，mRNA無法翻譯。
mRNA poly A尾巴的優(yōu)化
1.?避免poly A尾巴縮短
在細菌擴增過程中，攜帶長的聚均核苷酸序列的質(zhì)粒會產(chǎn)生不可預測的重組事件，質(zhì)粒上的poly A尾巴隨著細菌的不斷擴增發(fā)生縮短，這會對攜帶過長poly A尾巴質(zhì)粒的克隆和擴增造成麻煩，因此研究人員展開對攜帶poly A尾巴的質(zhì)粒進行一系列的改進，希望可以找到避免poly A尾巴縮短的方法。
圖3 在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中poly A尾巴縮短，poly A尾巴越長，越不穩(wěn)定。
2016年，Kyle Jacoby等人[2]發(fā)表文章peVl: A linear Plasmid for generating mRnA IVt templates With extended encoded Poly(A) sequences，首次研究攜帶不同長度poly A的質(zhì)粒在細菌擴增過程中尾巴的長度穩(wěn)定性情況，他們發(fā)現(xiàn)，poly A尾巴長度是72 bp時，轉(zhuǎn)化細菌，過夜培養(yǎng)后，其長度可以保持不變；當poly A尾巴加長到172 bp時，隨著質(zhì)粒擴增，自發(fā)的刪除突變開始出現(xiàn)；當poly A尾巴達到更長的325 bp時，此時極度不穩(wěn)定，甚至很難獲得陽性的克隆子（圖3）。為了消除環(huán)形質(zhì)粒上ploy A尾巴的不穩(wěn)定性，Kyle Jacoby等人將不同長度的poly A尾巴插入克隆位點，開發(fā)出基于N15噬菌體的pEVL線性質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)源自PJazz質(zhì)粒。PJazz質(zhì)粒是一種用來克隆含有重復或者不穩(wěn)序列基因組的線性質(zhì)粒系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)環(huán)形質(zhì)粒相比，在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中pEVL質(zhì)粒上poly A尾巴長度的維系有著顯著優(yōu)勢，甚至當尾巴長度達到500bp，可以成功獲得攜帶500bp Poly A尾巴的質(zhì)?？寺∽印?/strong>
圖4 間隔poly A序列會減少質(zhì)粒培養(yǎng)過程中引發(fā)poly A序列縮短的重組事件發(fā)生的概率
2019年，Zeljka Trepotec等人[3]發(fā)表文章Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life，發(fā)現(xiàn)把poly A序列間隔開來，可以顯著減少質(zhì)粒DNA擴增時的重組事件，維持尾巴長度，同時不影響體外轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的翻譯效率和半衰期。
PAPB需要的最短結(jié)合位點序列長度是12nt，但是單個的PAPB分子結(jié)合到mRNA上是不足以啟動蛋白翻譯的。寡聚PAPB以占據(jù)27-30nt重復單位的方式結(jié)合mRNA poly A尾巴上。目前最長用的poly A序列長度是120nt，因此要確保間隔的poly A序列上至少結(jié)合一個寡聚PABP，所以在設(shè)計間隔poly A序列長度是選擇40nt，這樣的話，120nt poly A尾巴可以分成2個60nt或者3個40nt，中間用Spacer序列分割。經(jīng)過一系列的測試，發(fā)現(xiàn)攜帶間隔poly A尾巴序列的質(zhì)粒，在培養(yǎng)過程中重組事件發(fā)生顯著下降，而且不會對該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成的mRNA的蛋白翻譯效率和穩(wěn)定性造成影響（圖4）。Pfizer-BioNTech公司就使用此策略在A30和A70之間用10個堿基GCATATGACT連接，開發(fā)了針對SARS-CoV-2的疫苗BNT162b2。
2.延長mRNA半衰期
近日，香港科技大學曠怡團隊[4]在Molecular Therapy發(fā)表了題為“Cytidine-containing tails robustly enhance and prolong protein production of synthetic mRNA in cell and in vivo（含胞嘧啶核苷尾可顯著增強細胞和體內(nèi)合成mRNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并延長半衰期）”的研究，本研究通過對尾部非A核苷酸的系統(tǒng)替代實驗，首次證明含胞苷C序列作為合成mRNA的尾部可提高合成mRNA的表達強度和表達時間。此外，C取代還可以抵抗mRNA的降解，從而延長其半衰期。
圖5 尾部末端的核苷酸取代對mRNA翻譯的影響
為了研究尾部的非A核苷酸對mRNA蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響，本研究首先合成了一系列具有40nt尾的EGFP mRNA，在3'端或附近進行不同的單核苷酸替換（圖5A）。轉(zhuǎn)染后24 h的相對表達分析（所有mRNA的表達峰值）顯示，EGFP-38ACA可顯著提高蛋白產(chǎn)量（圖5B）。
為了證實C替代對蛋白質(zhì)表達的促進作用，本研究構(gòu)建了尾部具有雙C替換的EGFP mRNA。結(jié)果表明，在尾部末端附近有相鄰或分離的雙C取代的mRNA都比有40A或38 ACA尾部的mRNA產(chǎn)生更多的EGFP，而尾部末端的雙C取代只會導致蛋白質(zhì)產(chǎn)量的輕微增強（圖5C）。
在所有檢測的細胞系中，盡管這些細胞系具有不同的基礎(chǔ)蛋白表達水平，但EGFP-37ACCA和EGFP-36ACACA產(chǎn)生的EGFP量明顯高于EGFP-40A（圖5D）。無論細胞系間蛋白質(zhì)表達增強程度的差異如何，數(shù)據(jù)都明確指出，尾部末端附近的C取代通?？梢哉T導合成mRNA的蛋白質(zhì)表達增強。
結(jié)語
3'端的poly A尾巴可以保護帽結(jié)構(gòu)不被降解，與poly A結(jié)合蛋白、5' Cap（帽結(jié)構(gòu)）和翻譯起始因子蛋白協(xié)同作用，啟動蛋白質(zhì)的翻譯。因此poly A尾的序列設(shè)計與優(yōu)化也是相當重要的。今天菌菌給大家詳細解析了poly A尾序列的設(shè)計與優(yōu)化，希望能夠在質(zhì)粒發(fā)酵生產(chǎn)中避免poly A序列發(fā)生堿基丟失造成尾巴縮短以及延長mRNA的半衰期。如有poly A尾相關(guān)問題，可私信菌菌：13380332910（微信同號）。
參考文獻：
[1] WAHLE E, R EGSEGGER U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes [J]. FEMS microbiology reviews, 1999, 23(3): 277-95.
[2] GRIER A E, BURLEIGH S, SAHNI J, et al. pEVL: A Linear Plasmid for Generating mRNA IVT Templates With Extended Encoded Poly(A) Sequences [J]. Molecular therapy Nucleic acids, 2016, 5(4): e306.
[3] TREPOTEC Z, GEIGER J, PLANK C, et al. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life [J]. RNA (New York, NY), 2019, 25(4): 507-18.
[4] LI C Y, LIANG Z, HU Y, et al. Cytidine-containing tails robustly enhance and prolong protein production of synthetic mRNA in cell and in?vivo [J]. Molecular therapy Nucleic?acids, 2022, 30: 300-10.
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