日前，一項(xiàng)刊登在國際雜志Cell上題為“CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing：Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors”的綜述文章中，來自馬賽諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們描述了以CRISPR為基礎(chǔ)的改善人類健康的策略，其重點(diǎn)是通過利用AAV載體將CRISPR療法直接導(dǎo)入人體，此外，研究人員還討論了目前廣泛應(yīng)用基于CRISPR療法所要面臨的挑戰(zhàn)，并強(qiáng)調(diào)了持續(xù)的研究和技術(shù)革新對(duì)于推動(dòng)基于CRISPR療法在人類疾病研究中的重要性。

圖片來源：Dan Wang,et al. Cell,doi:10.1016/j.cell.2020.03.023

目前應(yīng)用基于CRISPR的治療性手段能直接應(yīng)用于患者體內(nèi)，有望治療多種人類疾病，盡管基于CRISPR的工具箱能夠?qū)NA和RNA編輯及基因表達(dá)調(diào)節(jié)進(jìn)行多種操作，但其藥物的運(yùn)輸仍然是該療法發(fā)展的瓶頸，目前，腺相關(guān)病毒（AAV）載體是進(jìn)行體內(nèi)基因治療的主要載體；AAV非常安全，其能將單鏈DNA（ssDNA）載體基因組運(yùn)輸?shù)蕉鄠€(gè)組織和細(xì)胞類型中，而且僅在一定劑量范圍內(nèi)具有輕度的免疫原性；盡管載體基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)大部分處于游離狀態(tài)，但通過共分化和環(huán)化來介導(dǎo)有絲分裂后細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，就能使其穩(wěn)定下來并產(chǎn)生持久的治療效果，AAV載體在運(yùn)輸基因療法到疾病動(dòng)物模型和患者中推動(dòng)了基于CRISPR療法在治療多種疾病中的應(yīng)用。

AAV-CRISPR療法的進(jìn)展也面臨著AAV基因療法發(fā)展中普遍存在的一系列障礙，比如預(yù)先存在的對(duì)AAV衣殼的免疫力及載體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、運(yùn)輸效率和特異性及AAV載體的開發(fā)等；此外，臨床應(yīng)用的AAV-CRISPR也提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)，其就需要獨(dú)特的解決方案；在已有抗Cas9免疫存在的情況下，將定向Cas9蛋白直接運(yùn)輸?shù)饺梭w是否會(huì)降低其安全性或治療效果，這仍然有待于進(jìn)一步評(píng)估；解決免疫原性問題的潛在途徑包括使用免疫正交Cas9標(biāo)準(zhǔn)且進(jìn)一步探索CRISPR系統(tǒng)的自然多樣性，從而識(shí)別可能對(duì)人類免疫原性較低的新酶；此外，多種蛋白質(zhì)工程化方法也能夠改善臨床相關(guān)的特征，比如為了更好的免疫功能而繪制和編輯表位。

對(duì)于任何基因組編輯療法都需要仔細(xì)評(píng)估脫靶編輯效應(yīng)，近年來，科學(xué)家們開發(fā)出了多種方法來分析基于CRISPR試劑的脫靶特性；盡管這些方法在核酸序列水平上能提供對(duì)脫靶點(diǎn)的敏感性測(cè)定，但任何脫靶事件的潛在生物學(xué)后果在很大程度上都必須通過經(jīng)驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)估；由于脫靶效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重依賴于物種特異性的基因組序列和體內(nèi)給藥的方式，因此，在細(xì)胞或組織水平下利用人源化動(dòng)物模型就能夠提供有價(jià)值的臨床前信息，為了改善特異性，多種蛋白質(zhì)工程學(xué)方法就能夠產(chǎn)生高保真度的Cas和Cas效應(yīng)融合蛋白。以CRISPR為基礎(chǔ)治療手段的其它組分，比如sgRNA和供體模板，就能夠被修飾從而增強(qiáng)編輯的準(zhǔn)確性和編輯效率。

除了脫靶編輯之外，目標(biāo)編輯還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一些不希望發(fā)生的編輯事件，比如延伸到附近基因的大片段缺失、染色體重排（包括倒位和易位）及AAV載體基因組整合等；分析這些事件通常需要一系列不同于監(jiān)測(cè)脫靶裂解的技術(shù)，而值得注意的是，治療性的基因組編輯策略會(huì)協(xié)同編輯器的作用以及該編輯器所誘發(fā)的多種細(xì)胞過程，比如利用核酸酶活性的情況下進(jìn)行的DNA損傷修復(fù)，因此，更好地理解相關(guān)細(xì)胞過程或能為改善基因組編輯的安全性提供更多寶貴的見解。

圖片來源：Dan Wang,et al. Cell,doi:10.1016/j.cell.2020.03.023

疾病動(dòng)物模型是轉(zhuǎn)化研究和療法開發(fā)中的關(guān)鍵，由于體內(nèi)遞送是AAV-CRISPR療法的主要瓶頸，因此直接在疾病動(dòng)物模型中進(jìn)行檢測(cè)是評(píng)估療法有效性的金標(biāo)準(zhǔn)，由于AAV基因替代療法旨在運(yùn)輸功能性的基因拷貝來糾正引發(fā)疾病的基因拷貝，因此由多種基因敲除策略所建立的動(dòng)物模型通常情況下是足夠的。相比之下，諸如堿基編輯（base editing）和prime編輯（prime editing）等多種基因組編輯策略通常會(huì)靶向作用特定的突變，因此攜帶有意設(shè)計(jì)工程化突變的動(dòng)物模型就需要提供一個(gè)合適的檢測(cè)憑條，比如，研究人員會(huì)開發(fā)出攜帶代表性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因(dystrophin gene)突變的多個(gè)DMD小鼠模型來闡明多種基因編輯療法的有效性；盡管基于CRISPR基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了遺傳性修飾動(dòng)物的產(chǎn)生，但由于缺乏攜帶患者相關(guān)基因突變的適合動(dòng)物模型，這對(duì)于科學(xué)家們而言仍然是一大挑戰(zhàn)，而開發(fā)簡(jiǎn)單、強(qiáng)大且快速的動(dòng)物模型方法或許就會(huì)加速精準(zhǔn)基因編輯策略的開發(fā)。

CRISPR和AAV僅僅是闡明人類能夠利用自然系統(tǒng)來開發(fā)革命性生物技術(shù)的兩個(gè)例子，其凸顯了對(duì)自然多樣性理解和欣賞給科學(xué)家們帶來的機(jī)遇，然而對(duì)微生物機(jī)體進(jìn)行適應(yīng)性改造來滿足人類的需求并不能保證一定會(huì)成功；這個(gè)適應(yīng)過程涉及多個(gè)跨學(xué)科的研究領(lǐng)域，比如微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白工程學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)等，對(duì)于基于CRISPR的技術(shù)而言，其設(shè)計(jì)和利用的簡(jiǎn)單性并不應(yīng)該掩蓋共享有價(jià)值資源和技術(shù)的重要性，比如從質(zhì)粒到sgRNA文庫，再到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和生物信息學(xué)工具等，其能夠鼓勵(lì)科學(xué)家們進(jìn)行交叉驗(yàn)證并快速采用該技術(shù)進(jìn)行新的應(yīng)用，同時(shí)也能夠促進(jìn)科學(xué)家們繼續(xù)快速進(jìn)行科學(xué)研究。

一般而言，運(yùn)輸是阻礙體內(nèi)基因療法最主要的障礙之一，包括基因編輯治療性手段；AAV載體是目前最有效的基因運(yùn)輸工具，同時(shí)其也是被批準(zhǔn)能將基于CRISPR的基因編輯療法直接運(yùn)輸?shù)饺祟愺w內(nèi)的唯一一個(gè)運(yùn)輸載體。關(guān)于目前正在進(jìn)行的AAV-CRISPR臨床試驗(yàn)并對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析將會(huì)是非常讓人激動(dòng)的，這種改進(jìn)預(yù)計(jì)會(huì)來自于對(duì)基于CRISPR試劑進(jìn)行修飾以適應(yīng)AAV載體的內(nèi)在特性，以及目前正在進(jìn)行的AAV生物學(xué)和矢量學(xué)研究，將這兩個(gè)領(lǐng)域的研究成果進(jìn)行合并或有望產(chǎn)生一個(gè)更為廣泛的傳遞平臺(tái)，從而使其更好地服務(wù)于新型的分子療法中。

參考資料：

Dan Wang, Feng Zhang, Guangping Gao. CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors, Cell, 2 April 2020, Pages 136-150, doi:10.1016/j.cell.2020.03.023

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