常規(guī)Bulk RNA測(cè)序分析預(yù)后模型思路很常見。

但如何靈活加入單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，為分析思路增加亮點(diǎn)？

還有新方向鞘脂代謝等你來看~

如果小云問你：分析單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)能得到什么？

你可能多多少少會(huì)說出一些，比如了解樣本的異質(zhì)性、分析細(xì)胞亞群、單細(xì)胞的差異基因。。。

但如果問：如何能靈活應(yīng)用單細(xì)胞數(shù)據(jù)，為整體的分析思路助力呢？

你可能需要思考幾分鐘、幾個(gè)小時(shí)或者直接放棄思考。。。

（不知道如何找熱點(diǎn)或創(chuàng)新升級(jí)的可以找小云，各種個(gè)性化分析思路等你來挑~）

小云今天要給你介紹一個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的巧妙用法：可以將單細(xì)胞數(shù)據(jù)和WGCNA聯(lián)合篩選關(guān)鍵基因！

別急，今天還有一個(gè)重點(diǎn)要分享，就是代謝分析的新方向--鞘脂代謝(sphingolipmetabolism, SM)！

鞘脂是脂類的重要組成部分，鞘脂代謝密切參與細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控，為各種疾病的生理病理研究提供了基礎(chǔ)（ps：劃重點(diǎn)，腫瘤和非腫瘤疾病都可以分析哦~）。鞘脂代謝是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用，還調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、衰老和細(xì)胞周期阻滯，參與炎癥、血管內(nèi)皮屏障、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)、平滑肌收縮和舒張等等（ps：功能涉及如此廣泛，趕快關(guān)注起來吧~）。

SM的關(guān)鍵酶和中間產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞并進(jìn)一步影響臨床預(yù)后，在乳腺癌患者的血清中檢測(cè)到異常水平的鞘脂分子。

那么，分析鞘脂代謝相關(guān)基因的生信思路就順理成章了！趕快來看看吧~

題目：探究鞘脂相關(guān)基因在乳腺癌臨床轉(zhuǎn)歸中的作用

雜志：Frontiers in immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時(shí)間：2023年2月

數(shù)據(jù)信息

研究思路

從TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌（BC）數(shù)據(jù)，進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析(scRNA-seq)、加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析。然后通過Cox回歸、Lasso回歸分析，篩選出7個(gè)鞘脂相關(guān)基因(SRGs)，構(gòu)建BC患者的預(yù)后模型。最后，通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了關(guān)鍵基因PGK1在模型中的表達(dá)和功能。

流程圖

主要研究結(jié)果

1.?單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，所有細(xì)胞被劃分為19個(gè)更詳細(xì)的簇(圖1A)。有8種不同類型的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等(圖1B)。使用AUCell R包檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞的鞘脂代謝(SM)活性，分析鞘脂相關(guān)基因(SRGs)的表達(dá)特征?；虮磉_(dá)越多的細(xì)胞AUC值越高，主要是橙色B細(xì)胞和漿細(xì)胞(圖1C, D)。所有細(xì)胞都進(jìn)行SRGs的AUC評(píng)分，并根據(jù)AUC評(píng)分閾值分為兩組(高、低鞘脂-AUC組)。進(jìn)行差異表達(dá)和功能分析，確定兩組之間的DEGs和通路(圖1E)。

圖1. 細(xì)胞亞群注釋和差異表達(dá)基因鑒定

2.?加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA用于尋找與鞘脂相關(guān)的基因（圖2E），12個(gè)非灰色模塊中，藍(lán)色和棕色模塊與SM的關(guān)系最密切（圖2F），獲得關(guān)鍵模塊基因。

圖2. 加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

3.?鞘脂相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

將在單細(xì)胞中獲得的影響鞘脂代謝活性的最相關(guān)基因與模塊相關(guān)基因取交集，得到303個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)分析(圖3A)。單因素分析共獲得63個(gè)預(yù)后基因。接下來采用LASSO Cox回歸分析篩選出7個(gè)模型基因，建立預(yù)后模型(圖3B)。計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)與鞘脂相關(guān)的預(yù)后模型在預(yù)測(cè)患者結(jié)局時(shí)是高度準(zhǔn)確的（圖3F-G）。

（ps：cox回歸篩選預(yù)后標(biāo)記基因構(gòu)建評(píng)分模型可以用小云新開發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺(tái)包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html?）。

圖3. 鞘脂相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

4.?構(gòu)建Nomogram、預(yù)后特征的臨床病理分析和突變分析

利用臨床信息和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，創(chuàng)建nomogram（圖4A），以更準(zhǔn)確地量化BC患者的風(fēng)險(xiǎn)，決策曲線表明該nomogram可以有效預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

臨床熱圖確定兩個(gè)危險(xiǎn)組之間臨床特征的差異（圖4B），結(jié)果顯示兩組腫瘤年齡、T、N分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

進(jìn)一步分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組的基因突變差異，兩組間腫瘤突變負(fù)荷(TMB)差異顯著（圖4F），風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)與TMB值呈正相關(guān)（圖4G），并分析了TMB聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)OS的預(yù)后影響（圖4H-I）。

圖4. 構(gòu)建Nomogram、預(yù)后特征的臨床病理分析和突變分析

5.?免疫微環(huán)境分析

使用CIBERSORT方法確定了每個(gè)樣本中的22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度（圖5A）。低風(fēng)險(xiǎn)組有更高的間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分（圖5C），表明該組有更高的總體免疫水平和TME的免疫原性。還分析了兩組間免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的變化情況（圖5D），發(fā)現(xiàn)37個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因在低風(fēng)險(xiǎn)患者中顯著上調(diào)。

圖5. 免疫微環(huán)境分析

6.?SRGs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)治療反應(yīng)

將高、低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫分型與傳統(tǒng)免疫分型進(jìn)行比較（圖6A），顯示各組的免疫表型差異顯著。進(jìn)行腫瘤免疫功能障礙和排除(TIDE)分析（圖6B），由于TIDE評(píng)分較低，高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)免疫治療的反應(yīng)更好。進(jìn)一步研究SRG風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)相關(guān)信號(hào)、免疫相關(guān)基因的關(guān)系。

圖6. SRGs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)治療反應(yīng)

7.?關(guān)鍵基因PGK1的泛癌分析、驗(yàn)證及其與預(yù)后的關(guān)系

PGK1表達(dá)水平的泛癌分析顯示（圖7A），相對(duì)于正常組織，PGK1在BC中高表達(dá)。預(yù)后分析顯示，PGK1高表達(dá)患者預(yù)后不良（圖7B-E）。采用20對(duì)乳腺癌組織樣本（圖7F）和乳腺癌細(xì)胞系驗(yàn)證了PGK1的表達(dá)和潛在功能（圖7G-H），證實(shí)上述分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖7. 關(guān)鍵基因PGK1的泛癌分析、驗(yàn)證及其與預(yù)后的關(guān)系

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總結(jié)

這篇文章的創(chuàng)新點(diǎn)就是基于鞘脂代謝相關(guān)基因進(jìn)行了生信分析，之后的預(yù)后模型、構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、分析不同風(fēng)險(xiǎn)組患者腫瘤微環(huán)境、構(gòu)建nomogram等均為常規(guī)分析。基于代謝的生信分析方向又添一員大將~

值得借鑒的作者巧妙的運(yùn)用了單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析和和WGCNA聯(lián)合篩選鞘脂代謝關(guān)鍵基因的方法，新穎的分析思路也是亮點(diǎn)之一。

另外還有后續(xù)關(guān)鍵基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也是很好的加分項(xiàng)。整體看來有上述因素的幫助，常規(guī)預(yù)后模型思路發(fā)到8分+也是實(shí)至名歸~

如果你還苦惱于生信分析沒有思路，或者嫌分析方法太過簡(jiǎn)單、太過老套，想要?jiǎng)?chuàng)新思路的，或者對(duì)鞘脂代謝等熱點(diǎn)方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧!