一、概念：

核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。

二、原理：

? ? ? ? ?是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA;未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

? ? ? ? ?對(duì)于32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào);對(duì)于生物素標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，采用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。

? ? ? ? ?RPA是一種有力的工具，可用于檢測(cè)在總RNA混合物中特定mRNA分子的表達(dá)。盡管操作比較復(fù)雜，但是這種方法可以在一次檢測(cè)中分析多達(dá)25樣品。敏感性和高通量的優(yōu)點(diǎn)使得RPA在病原體的發(fā)現(xiàn)中顯得非常有用。由RPA得到的結(jié)果，結(jié)合普通的形態(tài)學(xué)技術(shù)有助于闡明疾病的發(fā)生過程。

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三、RPA有Northern Blot無法比擬的優(yōu)勢(shì)：

1、量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加完全

2、PA比Northern Blot靈敏15-150倍，適合檢測(cè)各種表達(dá)水平之基因

3、RPA通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)谕磺闆r下的差異表達(dá)

4、一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度

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四、這個(gè)方法的的主要缺點(diǎn)如下：

1、這個(gè)實(shí)驗(yàn)的前提是你必須首先要把要研究的基因克隆于一個(gè)載體，要清楚插入片段的方向，該載體插入片段兩側(cè)有T3、T7或SP6的啟動(dòng)子位點(diǎn)。載體先要用合適的內(nèi)切酶線性化，選擇正確的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，轉(zhuǎn)錄出要研究的mRNA 的互補(bǔ)鏈，再純化。總之RNA探針的制備夠麻煩。

2、核酸酶消化時(shí)，酶量的控制困難，容易消化過頭，X片上什么都沒有。

3、要用放射性同位素。從事生物研究的人誰不接觸放射性物質(zhì)?但是該方法中不同于一般的探針標(biāo)記，體積小，防護(hù)容易。它需要做垂直板狀PAGE，還要漂洗固定，粘有放射性的物質(zhì)太多，如電泳的緩沖液、電泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盤。這還沒有算上RNA探針標(biāo)記及隨后的純化過程。