前言

葉綠體能通過光合作用將二氧化碳轉(zhuǎn)化為碳水化合物，葉綠體功能對蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，細胞器功能和植物發(fā)育至關(guān)重要。然而關(guān)于光合作用中的核心調(diào)控機制目前還未知。作者發(fā)現(xiàn)光合作用蛋白（包括由葉綠體基因內(nèi)部編碼的蛋白）通過葉綠體蛋白降解途徑——Chloroplast-associated Protein Degradation（CHLORAD）發(fā)生泛素化修飾。然后這些蛋白被CDC48逆轉(zhuǎn)錄到細胞質(zhì)上后由細胞質(zhì)中的蛋白酶體進行降解。這表明CHLORAD直接參與調(diào)控葉綠體內(nèi)部蛋白，對葉綠體的作用可延伸到細胞器的內(nèi)部，用于揭示調(diào)控光合作用的新模式。

2022年11月，中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所凌祺樺研究組在Science advances發(fā)表了題為“Ubiquitin-based pathway acts inside chloroplasts to regulate photosynthesis”的研究文章，作者發(fā)現(xiàn)葉綠體蛋白降解途徑Chloroplast-associated Protein Degradation（CHLORAD）通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS），調(diào)控葉綠體外膜蛋白（OEM）逆轉(zhuǎn)運，并被細胞質(zhì)中的蛋白酶體降解。表明CHLORAD可以直接參與調(diào)控一些葉綠體內(nèi)部蛋白，參與葉綠體功能，如光合作用、脂質(zhì)代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、抗逆性等，進一步挖掘了CHLORAD的生物學意義。

中文標題：基于泛素的途徑在葉綠體內(nèi)起作用以調(diào)節(jié)光合作用

研究對象：擬南芥植株

發(fā)表期刊：Science advances

影響因子：14.957

發(fā)表時間：2022年11月

運用組學生物技術(shù)：Label free非標記蛋白質(zhì)組學、泛素化蛋白質(zhì)組學、擬靶向脂質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學

技術(shù)流程

主要內(nèi)容

1.通過分離和親和純化檢測葉綠體內(nèi)部的泛素化

對擬南芥葉綠體進行免疫印跡，檢測到純化葉綠體中高分子量條帶（圖1A）。條帶在嗜熱菌蛋白酶（一種去除表面暴露的OEM蛋白的蛋白酶；（圖1B）處理葉綠體后仍存在，表明泛素化蛋白可能存在于葉綠體內(nèi)部，如內(nèi)包膜（IEM）、基質(zhì)或類囊體膜。基質(zhì)有中泛素化蛋白存在（圖1C），證明CHLORAD有可能作用于葉綠體內(nèi)部蛋白質(zhì)。

圖1 |?葉綠體內(nèi)部的蛋白質(zhì)被泛素化

2.?泛素化蛋白組學揭示參與光合作用的蛋白被泛素化

為確定葉綠體中CHLORAD底物的泛素化目標及其修飾位點，對野生型擬南芥葉綠體進行蛋白質(zhì)組學分析。使用CDC48的顯性陰性突變體（CDC48-DN）來阻斷CHLORAD底物的逆轉(zhuǎn)錄。已確定的CHLORAD底物在光合作用成分中顯著富集（圖2A）。除了OEM蛋白，TOC成分和SP1、SPL2等蛋白，還鑒定出較多的IEM、基質(zhì)和類囊體蛋白，包括脂氧酶LOX2，捕光葉綠素結(jié)合蛋白（LHCPs），以及光系統(tǒng)亞基，如PsaA，PsaB和PsbC（圖2B）。

綜上研究表明：泛素化是調(diào)節(jié)葉綠體蛋白質(zhì)組的一個主要機制，特別是在光合作用方面。葉綠體泛素組每個蛋白質(zhì)有2.7個泛素化位點，表明葉綠體蛋白廣泛泛素化（圖2C），多泛素連接類型都存在于葉綠體中（圖2D）。此外，還發(fā)現(xiàn)了一個泛素連接假定的共識基序（圖2E），在以前的全球植物泛素組中沒有觀察到，這表明一個特定的泛素化過程可能發(fā)生在葉綠體內(nèi)。

圖2 |?光合作用和葉綠體內(nèi)部的其他蛋白質(zhì)在葉綠體泛素組中很突出

3.定量蛋白質(zhì)組學顯示，CHLORAD可調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的水平

CHLORAD底物穩(wěn)態(tài)水平在CHLORAD被抑制后會增加。為尋找在CDC48抑制后過度積累的葉綠體蛋白，對表達CDC48-DN或相應(yīng)的CDC48-野生型（WT）對照的擬南芥進行了非標定量蛋白質(zhì)組分析。兩種基因型中部分蛋白質(zhì)在CDC48-DN中相對于對照組存在表達水平較高（圖3A-B），TOC成分（Toc159、Toc33和Toc75）在CDC48-DN中過度累積。不同驗證分析方法都顯示了這些蛋白在CDC48-DN細胞中升高，積累的蛋白質(zhì)在每種情況下都定位在葉綠體中。蛋白質(zhì)組學中檢測到的238個蛋白質(zhì)中，至少含有一個泛素化位點，其中79個（33%）在CDC48-DN葉綠體中過度累積（圖3C），支持它們是CHLORAD底物的觀點。

RNA測序（RNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)，雖然有許多依賴于CDC48的轉(zhuǎn)錄變化，但大多數(shù)編碼在CDC48-DN葉綠體中過度積累蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本沒有上調(diào)（圖3D-E）。與蛋白質(zhì)水平相反，在CDC48-DN擬南芥中，葉綠體蛋白的mRNA趨于減少（圖3D），代表蛋白質(zhì)豐度的變化是通過翻譯后過程介導(dǎo)的。

圖3 | 運用定量蛋白質(zhì)組學鑒定眾多的CHLORAD底物

4.證明CHLORAD參與內(nèi)部葉綠體蛋白的降解

本研究中，許多內(nèi)部葉綠體蛋白（非OEM蛋白）被意外地推測為CHLORAD的底物。為證實這些蛋白是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)處理的，并確定它們在蛋白酶體抑制后的降解情況。本研究用抑制蛋白酶體和CHLORAD活性的硼替佐米進行處理，發(fā)現(xiàn)PrfB3-HA的降解被推遲了（圖4A-B）。接下來本研究分析了幾個葉綠體編碼蛋白在CHLORAD缺陷sp2和CDC48-DN背景下的轉(zhuǎn)換。在用林可霉素處理以抑制葉綠體翻譯后，監(jiān)測蛋白水平。PsaA和PsbC（假定的底物和光合作用成分）的穩(wěn)定性在CHLORAD缺陷基因型中明顯增強（圖4C-H）。RPL2（一種葉綠體編碼的核糖體蛋白，未被確定為CHLORAD的推定蛋白，用作對照）在sp2和CDC48-DN的背景中不穩(wěn)定。表明CHLORAD會選擇性地作用于多種內(nèi)部底物，但不是所有的葉綠體蛋白。

為建立CHLORAD與其在葉綠體內(nèi)部的假定目標之間的直接聯(lián)系，進行免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)SP2-6Myc與PrfB3-HA有特異性關(guān)聯(lián)，包括多泛素化的高分子量形式（圖4I）。CHLORAD對內(nèi)部底物穩(wěn)定性的作用可能是通過直接的物理相互作用來介導(dǎo)的。

圖4 |?葉綠體內(nèi)部的蛋白質(zhì)由CHLORAD處理

5.證明了CDC48在提取內(nèi)部葉綠體蛋白中的作用

由于CDC48驅(qū)動CHLORAD底物從OEM到細胞膜的逆轉(zhuǎn)定位，為評估CDC48是否同樣參與了從葉綠體內(nèi)部提取底物的過程，本研究對兩種葉綠體編碼的底物（PsaA和PsbC）進行了體內(nèi)逆轉(zhuǎn)定位實驗。從CDC48-DN和CDC48-WT擬南芥中將硼替佐米處理過的原生質(zhì)體分離出來并生成葉綠體和細胞質(zhì)，通過免疫沉淀富集泛素化蛋白。通過免疫印跡法檢測葉綠體和細胞質(zhì)樣品中PsaA和PsbC蛋白（圖5A）。多聚泛素化的PsaA和PsbC被明顯提取到細胞質(zhì)中，表明葉綠體內(nèi)部蛋白可以從細胞器中輸出，CDC48在處理這種內(nèi)部葉綠體蛋白中起著重要作用（圖5）。

圖5 |?CDC48是提取多泛素化光合作用蛋白的必要條件

6.評估CHLORAD對光合作用和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的生理重要性

CDC48-DN的短期表達會導(dǎo)致植物萎黃（圖6A），研究發(fā)現(xiàn)CDC48-DN擬南芥的葉綠體含有擴大的質(zhì)體球（圖6B-C），與光系統(tǒng)成分平衡被破壞而引起的氧化應(yīng)激結(jié)果一致，與幼苗的萎黃表型有關(guān)（圖6B和D）。CDC48-DN葉綠體含有較大的顆粒（堆積的類囊體，PSII集中于此）和較少的基質(zhì)類囊體（圖6B和E）。本研究接下來分別在CDC48-DN和sp2突變體擬南芥以及相應(yīng)的對照組中，同時測量了PSI和PSII的能量轉(zhuǎn)換，確定電子傳輸率（ETR）參數(shù)ETR(I)和ETR(II)（圖6F-I）。雖然CDC48-DN和sp2擬南芥沒有顯示出與各自對照組的明顯差異，但ETR(II)值都明顯升高，意味著CHLORAD通常會限制PSII活性。

葉綠體也是植物中脂肪酸合成的主要場所。通過泛素組學和定量蛋白質(zhì)組學，兩個參與脂肪酸代謝的葉綠體外膜蛋白FAX1和LACS9被確定為候選CHLORAD底物。CDC48-DN中，總共檢測到24種水平顯著不同的脂肪酸（Fatty Acids）。葉綠體產(chǎn)生的FAs（16:0，18:0，18:1）減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的FA（24:0；圖6J）增加，支持CHLORAD影響FA到功能性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的假設(shè)。除了溶血磷脂酰膽堿（18:3）和磷脂酰甘油（16:0/18:1；圖6J）之外，大多數(shù)脂質(zhì)種類在CDC48-DN擬南芥中都明顯減少。反映了與CHLORAD正常調(diào)節(jié)喪失相關(guān)的脂肪酸和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞。

圖6 |?CHLORAD 是正常光合功能和脂質(zhì)體內(nèi)平衡所必需的

內(nèi)容總結(jié)

本研究確定了CHLORAD的靶標和泛素化位點。通過蛋白質(zhì)組學、泛素化蛋白質(zhì)組學、擬靶向脂質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等分析，發(fā)現(xiàn)CHLORAD直接作用于多種葉綠體蛋白，并且泛素-蛋白酶體系統(tǒng)廣泛影響葉綠體功能，包括光合作用和脂質(zhì)代謝。這些發(fā)現(xiàn)為栽培植物的改良提供了機會（例如，最大限度地提高光合活性），有助于為解決糧食安全和碳中和等全球挑戰(zhàn)提供參考。

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由于植物雙膜包膜的物理屏障，過去內(nèi)部葉綠體蛋白不被認為是細胞質(zhì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和CHLORAD的可能目標。該文章結(jié)合蛋白質(zhì)組學、泛素化蛋白質(zhì)組學、擬靶向脂質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等分析，揭示了葉綠體內(nèi)部的蛋白質(zhì)，包括IEM、基質(zhì)和類囊體中的蛋白質(zhì)，是可以被CHLORAD靶向作用的，并在葉綠體內(nèi)部進一步發(fā)揮調(diào)節(jié)光合作用，脂類代謝等功能。

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