科學家在做細胞基因敲除之前會基因敲低，但由于shRNA技術本身的限制，無法得到基因功能完全缺失的細胞(一般shRNA約為70%敲除)，甚至經常發(fā)生shRNA敲低了，但細胞WB效果不好；同時Knockout也會出現使用碼移敲除導致敲除不干凈的問題！所以最后我們會選擇細胞基因敲除(大片段敲除)的方法，徹底敲除基因的蛋白質功能。如何才能高效敲除細胞基因的大片段？我們將在下面說明周期和方法：

1、選擇性敲除基因位置、細胞敲除載體構建：

我們選擇1-10kb的片段大小進行敲除，這個效率比較合適；一般選擇能非3倍數外顯子比較好。如果沒有，問題也不大，只能選擇大片段來做了；

可以設計合成Dual-gRNA，通過PCR將目的gRNA構建到敲除載體中，測序：

細胞的制備和轉染：

我們一般采用電轉構建敲除細胞系

A、脂質體參考各公司說明書；

B、如果用電轉，效率會高1倍；

使用我們專有的VIRUS-Free技術，其效率與使用病毒的效率相當(但周期縮短了一半)。

電轉后，經過3天的藥物篩選，可以制造單克隆：

A、單克隆環(huán)法：此類方法其優(yōu)點在于工作量小，只需將轉染或者病毒載體感染后的細胞按照一定的細胞密度轉移至新皿中，并使用合適的藥物進行篩選，最后在克隆環(huán)的幫助下對單克隆細胞株進行挑選，并在新皿中完成擴增。缺點在于需要對細胞密度和藥物濃度繪制致死曲線并選取合適的細胞密度和藥物濃度進行篩選，一些細小的密度和濃度差別都會導致難以獲取均一的單克隆，結果導致獲取的克隆不純，含有非整合的細胞。穩(wěn)定整合的細胞在這樣一類混合細胞中，很快會失去生長優(yōu)勢，最終導致失去穩(wěn)定株。

B、ClonePlus技術：是我們研發(fā)的專用高效細胞敲除技能，主要經過高通量電轉體系和高通量的克隆分選技能結合，獲得基因修改的單細胞，其克隆構成率能夠達98%，就算是克隆構成率低的細胞株也能獲得敲除單克隆?！?-10天能夠完結絕大部分的細胞的單克隆工作】

PCR判定與擴增：

將獲得的單克隆在96孔中傳代，并將細胞進行PCR判定，由于我們使用大片段敲除，能夠直接進行PCR判定，無需雜亂的測序和讀圖判定過程；所以一般2天完成判定過程，然后就能夠將克隆細胞直接進行直接擴增，交給后面做RT-PCR檢測，保證其mRNA的完全敲除。

ClonePlus技術是整個敲除能加速的核心，能加快懸浮細胞的擴增周期：K562，THP-1等均適合。下圖是ClonePlus技術測驗過腫瘤細胞的類型供各位參閱：

以上內容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供