蛋白質的結構與其功能狀態(tài)緊密相連。蛋白的結構變化，如

翻譯后修飾、相互作用分子結合、寡聚化、聚集和切割

，可以調節(jié)蛋白質活性?，F有的生物物理方法可用于探測蛋白質結構變化，但

不適用于生物的整個蛋白質組研究

。青蓮百奧推出

無需化學修飾

的對復雜生物樣品中蛋白質結構變化進行全蛋白質組評估的解決方案——

限制性酶解-質譜分析技術(Limited proteolysis mass spectrometry, LiP-MS)

，助力于蛋白質的相互作用研究（特別是

藥物靶點發(fā)現

）及蛋白的功能狀態(tài)解析。本期，小編將系統(tǒng)地給大家介紹一下LiP-MS技術。

蛋白質結構與功能緊密相關

蛋白質的結構密切反映了其功能狀態(tài)，因為

結構整合了調節(jié)蛋白質活性的多層信息

。生物過程受分子間相互作用和化學修飾的調節(jié)，這些相互作用和修飾可能

不會影響蛋白質豐度水平

，從而逃脫了經典蛋白質組學篩選的檢測。例如酵母短時間內的應激反應通常與蛋白表達量無關，因此不太適合蛋白質豐度篩選。

LiP-MS無需化學修飾且同時提供結構變化和豐度變化的信息

化學蛋白質組學是注釋蛋白質功能和發(fā)現生物活性配體靶標的重要工具，例如基于活性的蛋白質分析（activity-based protein profiling，ABPP），但需要對待研究的小分子進行化學修飾，常常引發(fā)修飾后小分子集團過大及活性降低等問題，不利于后續(xù)的數據分析及結果驗證。許多生物物理方法可用于探測蛋白質結構變化，例如NMR質譜和X射線晶體學等，但這些方法不適用于生物的整個蛋白質組。

LiP-MS是一種最近開發(fā)的不需要化學修飾研究蛋白相互作用的新方法，能夠在蛋白質組范圍內直接在復雜的生物環(huán)境中識別相互作用引發(fā)的結構變化。

當蛋白構象發(fā)生變化時（例如與小分子結合），

相對于原蛋白由于位阻變化遮蓋廣譜酶的酶切位點

，廣譜酶優(yōu)先切割蛋白質暴露在外的柔性部分(環(huán)或者未折疊部分)，

與原蛋白相比產生不同的蛋白酶切片段

。一次酶切（LiP酶切）后再將蛋白樣品變性，用胰酶進行二次酶切。通過質譜檢測，比較不同處理條件的樣品中全酶切及半酶切肽段（LiP酶切）的信號強度變化，進而分析蛋白構象變化。

圖1??LiP-MS技術原理圖

LiP-MS技術優(yōu)勢

一、不需要額外的化學修飾

不需要對待研究的小分子進行化學修飾，規(guī)避了常規(guī)化學蛋白質質組學，如，基于活性的蛋白質分析（ABPP）帶來的分子集團過大和修飾后活性降低等問題，增加了實驗的可操作性及數據的真實性。

二、提供蛋白質/小分子-蛋白質相互作用（藥物-靶點）的結合序列信息

小分子（如藥物）的結合可以改變蛋白質的蛋白水解可及性，從而改變限制性酶（LiP）的水解模式。LiP-MS可以探測到酶的結構變化（自身的變構、酶-底物的相互作用以及酶-產物的相互作用）、蛋白質-代謝物的相互作用、蛋白質-核酸的相互作用、蛋白-蛋白的相互作用以及藥物與靶點的相互作用，對感興趣的小分子結合的蛋白質組中的蛋白質進行無偏檢測，并提供結合序列的信息。

三、適用樣本類型廣

目前LiP-MS已經成功的用于蛋白質溶液、組織、細胞、細菌、酵母等不同的生物系統(tǒng)中，除蛋白質溶液外其他生物系統(tǒng)中應用LiP-MS可以探測蛋白原位結構變化。

四、同時檢測蛋白質豐度和結構變化兩個維度的信息

同時設置了僅胰酶組（TrP組）以及限制酶和胰酶組（LiP組）：僅胰酶組（TrP組）檢測蛋白質豐度變化，同時對由于結構變化引起的LiP肽強度的變化與由蛋白質豐度變化引起的變化或由共價修飾、切割或序列變化引起的肽水平變化進行區(qū)分校正；限制酶和胰酶組（LiP組）則提供蛋白質結構變化信息。

五、檢測方式靈活

根據研究需求，靈活選擇靶向和非靶向的蛋白質組學檢測方式。與靶向蛋白質組學結合，（例如，選擇性反應檢測技術（MRM/SRM）），LiP-MS方法可用于在一種或幾種感興趣的蛋白質的生物基質中以高靈敏度和再現性來探測其結構變化。

LiP-MS的應用領域

2014年LiP-MS被首次應用，經過近十年的發(fā)展，目前已經廣泛應用于神經性疾病的新型生物標志物發(fā)現、藥物靶點發(fā)現以及蛋白質/小分子-蛋白質相互作用相互作用圖譜構建中，在解析腫瘤和疾病的發(fā)生發(fā)展、關鍵通路分子機制研究、新型生物標志物的發(fā)現以利于臨床以及后續(xù)的藥物治療中發(fā)揮重要作用。

一、檢測蛋白結構變化

從蛋白結構層面解析蛋白功能狀態(tài)的改變，研究腫瘤和疾病患者蛋白質組結構上的不同，深入研究癌癥和疾病的發(fā)生、發(fā)展機理。

二、鑒定新型疾病標志物

結構影響蛋白質的功能狀態(tài)，通過對人類結構蛋白質組進行全局分析并判斷其是否反映了病理變化，以及是否可以產生一種新型的疾病結構生物標志物，而不是傳統(tǒng)的基于豐度的疾病生物標志物。

三、 發(fā)現藥物靶點

通過檢測藥物結合靶蛋白導致的構象變化明確藥物靶點，解析藥物發(fā)揮作用的機制，利于疾病的治療及藥物的研發(fā)。

四、研究蛋白質/小分子-蛋白質相互作用

發(fā)現蛋白質/小分子（代謝物和DNA等）與蛋白質相互作用導致的結構變化，明確蛋白質/小分子（代謝物和DNA等）介導的酶、轉錄因子和轉運蛋白等一系列調控過程如何使細胞進行正常的生命活動。 小編也整理了近些年的代表文章，希望能給您提供一些思路~ 表1??LiP-MS代表文章

技術流程

青蓮百奧接收對照組和處理組樣品，并對兩組樣品平行設置TrP組和LiP組進行酶切處理，酶切后的肽段樣品經質譜檢測和蛋白定性及定量的搜庫處理后，進行生物信息分析。分析主要分為兩個維度：豐度和結構：差異蛋白篩選后進行通路富集分析和相互作用分析，其中結構差異蛋白進行了三維結構的展示，并圖示結合序列信息。為進一步挖掘關鍵信息，我們對豐度信息和結構信息進行聯合分析。青蓮百奧提供LiP-MS技術服務，可以幫您設計實驗指定個性化方案！歡迎大家前來咨詢~

圖2?LiP-MS技術流程

送樣指南

青蓮百奧支持接收組織、細胞和蛋白質溶液的樣品，具體接收信息如下： 表2??LiP-MS送樣指南