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文章題目：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of onvalescent patients’ B cells

雜志名稱：Cell

發(fā)表單位：北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG），首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，病原與生物安全國家重點實驗室，北京微生物研究所

發(fā)表時間：2020.05.13

主要技術(shù)：10x Genomics

Pick理由：新冠熱點，單細(xì)胞熱點，數(shù)據(jù)挖掘和結(jié)構(gòu)預(yù)測兩種方式預(yù)測中和抗體

技術(shù)背景

新冠肺炎疫情在全球快速擴散蔓延，目前感染人數(shù)已經(jīng)超過750萬人，死亡人數(shù)超過40萬。全球科研人員都在積極努力，期望找到對抗新冠病毒的有效藥物，但是目前仍沒有針對新冠肺炎的特效藥物批準(zhǔn)上市。中和抗體是一類靶向病原體并阻斷病原體入侵細(xì)胞的特異性免疫球蛋白，由人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可以有效阻止病毒感染細(xì)胞。在新冠肺炎肆虐全球時，分離出有效的新冠抗體是一個重要的抗役措施。研究表明，恢復(fù)期患者的血漿中含有由適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的中和抗體，對輕度和重度COVID-19患者進行治療，均有明顯臨床改善作用。然而血漿不能量產(chǎn)，限制了這種治療方法的廣泛使用。但是從康復(fù)病人的記憶B細(xì)胞中分離出中和性單抗確實一種有前景的干預(yù)治療方法，這種方法具有良好的可擴展性和治療效果。以病毒表面蛋白為靶點的人源單克隆抗體對艾滋病、埃博拉和中東呼吸綜合征等傳染病顯示出越來越多的治療和預(yù)防效果，它們對患者的安全性和效力已在多項臨床試驗中得到證實，因此對新冠也可以嘗試這種治療方案。6月5日，國家藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)中科院微生物所抗疫科技攻關(guān)團隊研制的新冠病毒全人源單克隆抗體的臨床試驗申請，I期臨床試驗將在健康人體內(nèi)進行安全和劑量測試，這也是全球首個已經(jīng)完成了非人靈長類動物實驗后，在健康人群中開展的新冠肺炎治療性抗體臨床試驗。這標(biāo)志著具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新冠病毒特異性抗體藥物成功進入人體臨床評價階段。

主要研究成果

1. 從60名新冠康復(fù)患者外周血中富集出B細(xì)胞，通過高通量單細(xì)胞RNA和VDJ測序快速鑒定出SARS-CoV-2中和抗體。2. 鑒定出14種有效的中和抗體，其中BD-368-2中和效應(yīng)最強。3. BD-368-2中和抗體對感染sars-cov-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠也有較強的治療和預(yù)防作用。4. BD-368-2中和抗體與spike-ectodomain三聚體復(fù)合物的3.8? 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示該抗體的表位與ACE2結(jié)合位點重疊。5. 證明SARS-CoV-2中和抗體可以根據(jù)其預(yù)測的CDR3H 結(jié)構(gòu)與SARS-CoV中和抗體的相似性直接選擇。在應(yīng)對大流行性傳染病時，通過高通量單B細(xì)胞測序可以有效地發(fā)現(xiàn)人的中和抗體。

實驗樣本

分6個批次共選取60例新冠康復(fù)病人的PBMC分離出B細(xì)胞，分別用CD27抗體和RBD蛋白分選特定類型的B細(xì)胞，進行單細(xì)胞RNA和單細(xì)胞BCR測序。CD27+富集細(xì)胞主要為記憶B細(xì)胞，生物素化RBD和S蛋白主要富集抗原結(jié)合的B細(xì)胞。經(jīng)過分選后每個樣本得到的B細(xì)胞數(shù)量并不多，因此采用多個樣本混合的方式。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，最終得到8,558種不同的IgG1抗原結(jié)合克隆型。

數(shù)據(jù)總覽

分析內(nèi)容

通過scRNA數(shù)據(jù)和scVDJ數(shù)據(jù)結(jié)合，將記憶B細(xì)胞分成了不同的亞類。圖D顯示了挑選克隆的標(biāo)準(zhǔn)，包括B細(xì)胞類型，富集頻率，可變區(qū)域突變頻率，產(chǎn)生的抗體類型等。一般認(rèn)為表達IgG1的B細(xì)胞對病毒刺激反應(yīng)強烈，且體細(xì)胞突變（SHM）頻率高的細(xì)胞親和力更強。經(jīng)過篩選最后篩選出169個理想候選克隆，通過轉(zhuǎn)染在HEK293細(xì)胞中表達。同時選擇了47個非理想克隆作為對照。通過ELISA，表面等離子體共振等實驗發(fā)現(xiàn)只有rbd結(jié)合單克隆抗體具有偽病毒中和作用，同時只有Kd小于或接近ACE2/RBD解離常數(shù)的單克隆抗體與RBD結(jié)合。

從豐富克隆型分離的中和單抗中，有7種具有較強的中和能力，其抗SARS-CoV-2假病毒的IC50低于0.05 mol / l。最強單克隆抗體是BD-368-2，與BD-368來自同一克隆型。為了評估它們對真實病毒的中和能力，作者使用從COVID-19患者中分離的真實SARS-CoV-2進行了血小板減少中和試驗（PRNT）。在所有測試的單克隆抗體中，BD-368-2對真實病毒的效力最高，IC50為15 ng/mL。為了進一步驗證PRNT顯示的真實的病毒中和作用，作者使用BD-218對真實的SARS-CoV-2進行了細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)抑制試驗。在1.2的濃度下，BD-218對所有三次重復(fù)均表現(xiàn)出完全的病毒抑制作用。

為了評估鑒定出的中和單克隆抗體能否在體內(nèi)對SARS-COV-2起到治療干預(yù)和預(yù)防性保護作用，作者測試了BD-368-2對感染SARS-COV-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的中和效果。9只hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠分成三組，小鼠實驗采用3組共9只hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。第一組在病毒感染前24小時，將BD-368-2腹腔注射進hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，檢測其預(yù)防效果。治療組在感染后2h注射BD-368-2。對照組在感染后2小時注射抗H7N9病毒IgG1抗體（HG1K）作為陰性對照。感染后5天內(nèi)，每天記錄每只小鼠的體重，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠體重明顯下降。作者通過qRT-PCR分析了5dpi時肺部的病毒載量，發(fā)現(xiàn)在病毒攻擊前注射BD-368-2可以完全抑制SARS-CoV-2。在感染2h后注射可以明顯降低病毒載量?？傊?，小鼠實驗證明BD-368-2在體內(nèi)具有較高的治療和預(yù)防作用。

通過克隆富集篩選有親和力的抗體是一種高效的方法，然而由于取樣限制，在很多樣本中，大量克隆并未出現(xiàn)明顯富集和擴增，可能導(dǎo)致信息的遺漏，因此使用抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測來注釋Ig-seq數(shù)據(jù)，可以更好地選擇單克隆抗體。研究表面通過比較與參考中和單抗CDR3H結(jié)構(gòu)的相似性選擇抗體是一種有效的方法。

然而對于新冠病毒來說，目前并無可用的參考抗體。

為了解決這一問題，作者使用3.8 ?分辨率下BD23-Fab與S胞外域三聚體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。在這個三維重建結(jié)構(gòu)中，每個S三聚體觀察到一個單一的BD23-Fab，它與原聚體B中的“下”RBD結(jié)合，且只有BD-23的重鏈可變區(qū)參與RBD結(jié)合。事實上，與RBD-ACE2復(fù)雜結(jié)構(gòu)的比較表明，BD23-Fab與ACE2競爭與RBD的結(jié)合。這一觀察結(jié)果表明，BD-23中和SARS-CoV-2的能力來自于ACE2-RBD結(jié)合的破壞，這與之前鑒定的中和SARS-CoV的單克隆抗體高度相似。綜上所述，SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的結(jié)構(gòu)有高度保守性，利用SARS-CoV中和單克隆抗體的晶體結(jié)構(gòu)作為參考，篩選具有相似CDR3H結(jié)構(gòu)的SARS-CoV-2抗原結(jié)合克隆型來識別中和單克隆抗體也是可行的。

鑒定出的單克隆抗體的CDR3H序列與m396 (2dd8)高度同源，通過破壞ACE2/RBD結(jié)合發(fā)揮中和SARS-CoV效應(yīng)。令人驚喜的是，作者發(fā)現(xiàn)的12個單克隆抗體中有7個表現(xiàn)出強烈的RBD結(jié)合親和力，對偽SARS-CoV-2病毒具有有效中和能力。三種具有代表性的單克隆抗體BD-503、BD-508和BD-515的中和能力在真SARS-CoV-2的PRNT中也得到驗證，顯示出很高的中和能力。這些單克隆抗體多編碼重鏈VH3-66/JH6或VH3-53/JH6基因片段，輕鏈VLK1-9或VLK1 -33/39基因片段。

使用雙抗體夾心ELISA進行的表位封裝實驗表明，BD-503、BD-508和BD-515可能共享一個重疊的表位。還需要更多的結(jié)構(gòu)分析來獲得準(zhǔn)確的表位，以確定它們是否具有較大的保守性。

小結(jié)

近日北京新冠確診人數(shù)的增加讓人們對新冠的警惕性進一步提升。作者鑒定的強中和抗體可能提供一種有效的治療和預(yù)防方案，在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠上的結(jié)果證明了這一點。使用BD-368-2的臨床試驗正在進行中。我們期待良好的臨床實驗結(jié)果，也期望本文中的方法可以擴展應(yīng)用到其他傳染病的研究與治療中。