前言

銀屑病是一種以表皮增生為特征的復(fù)發(fā)炎癥性皮膚病，涉及免疫細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞 (KCs) 之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。目前已經(jīng)在銀屑病的免疫激活方面取得了較多進(jìn)展，特別是確定了IL-17A 作為驅(qū)動(dòng)核心參與該病理過程。又有研究表明Hippo-YAP信號(hào)通路在細(xì)胞存活和組織生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用，其靶基因 AREG 可促進(jìn)銀屑病的發(fā)生。然而，IL-17A 是否通過調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號(hào)通路從而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖這一過程尚未被探索，所以，探索銀屑病調(diào)節(jié)機(jī)制的空白區(qū)域?qū)︺y屑病的治療是非常重要的。

近日，同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院史玉玲教授作為通訊作者，在Journal of Investigative Dermatology（IF=8.551）雜志發(fā)表了題為“IL-17A Promotes Psoriasis-Associated Keratinocyte Proliferation through ACT1-Dependent Activation of YAP–AREG Axis”的研究論文，報(bào)道了銀屑病關(guān)鍵細(xì)胞因子 IL-17A 影響皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞及其促進(jìn)表皮增厚的分子機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、PCR 技術(shù)、免疫印跡、免疫熒光分析以及共免疫沉淀等方法對(duì)銀屑病樣本進(jìn)行分析探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn) YAP-AREG 通路在銀屑病皮膚樣本中被激活，并且該通路可以被 IL-17A 單抗（治療劑）抑制，通過咪喹莫特 (IMQ) 和 IL-17A 誘導(dǎo)可以激活小鼠表皮中的 YAP-AREG 通路。HaCaT 和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的體外研究表明，IL-17A 通過激活 Hippo-YAP 信號(hào)傳導(dǎo)可以增強(qiáng) AREG 表達(dá)和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。從機(jī)制上講，IL-17A 刺激角質(zhì)形成細(xì)胞中 MST1 向 ACT1 的募集，這導(dǎo)致了 MST1-LATS1的相互作用和抑制 YAP 磷酸化?？偠灾芯拷Y(jié)果揭示了通過激活 YAP-AREG 信號(hào)傳導(dǎo)，IL-17A 促進(jìn)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的機(jī)制。

研究結(jié)果

YAP-AREG 通路在銀屑病患者的皮膚中被激活并被 IL-17A 單抗抑制

通過對(duì)人類銀屑病患者樣本的 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) YAP、TEAD4 及其靶基因（包括 AREG、BIRC5、CCNE1、EPGN 和 PLAU）的表達(dá)水平在銀屑病皮膚病變中普遍上調(diào)（圖 a)。通過 RT-qPCR 分析驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)（圖 b）。免疫熒光檢測(cè)到磷酸化 YAP 信號(hào)減少和 YAP 信號(hào)增加，尤其是在銀屑病病變中幾乎所有表皮 KC 的細(xì)胞核中（圖 c- d）。免疫熒光分析還揭示了表達(dá) AREG 的細(xì)胞從局限于健康表皮的基底層和棘層擴(kuò)展到包括銀屑病病變中的所有表皮層（圖 d）。這些結(jié)果表明 YAP 信號(hào)在銀屑病患者中被激活。

Secukinumab 是 IL-17A 的拮抗劑（IL-17A 單抗），近年來已報(bào)道出對(duì)銀屑病的顯著治療效果。為了檢查 IL-17A 抑制對(duì) YAP-AREG 的可能影響，收集了七名銀屑病患者在 Secukinumab 治療前和治療后 12 周的皮損皮膚組織。通過 RNA-seq 結(jié)果分析顯示， Secukinumab 給藥后，AREG、BIRC5、CCNE1、CTGF 和 EPGN 基因表達(dá)水平降低（圖 e）。

通過 RT -qPCR 分析驗(yàn)證 AREG 和 BIRC5 的減少（圖 f）。Secukinumab 應(yīng)用還增加了磷酸化 YAP 水平，但降低了患者皮膚表皮中 YAP 和 AREG 蛋白的表達(dá)（圖 g-h）。這些結(jié)果表明，IL-17A 抑制能夠減少銀屑病患者皮膚中的 YAP-AREG 活化。

圖1 | 銀屑病中 YAP-AREG 信號(hào)被激活并且 Secukinumab 治療能夠抑制該激活過程

IMQ 和 IL-17A 誘導(dǎo)小鼠皮膚組織能夠激活 YAP-AREG 信號(hào)

對(duì)于“YAP-AREG信號(hào)參與了銀屑病表皮增生過程，且與 IL-17A 作用密切相關(guān)”這一猜想，作者使用咪喹莫特 (IMQ) 誘導(dǎo)和 IL-17A 誘導(dǎo)的小鼠模型來進(jìn)行研究測(cè)試。正如預(yù)期的那樣，用 IMQ 治療的小鼠出現(xiàn)典型的銀屑病樣皮膚表型，包括表皮增生，以及 Il-17a 和增殖標(biāo)志物 Mki67 的顯著上調(diào)；與人類樣本的結(jié)果一致，在 IMQ 處理的小鼠損傷皮膚中可以看到 Areg 和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高，并且 YAP 信號(hào)在 IMQ 處理的表皮中被激活（圖 a - d）。

為了評(píng)估 IL-17A 對(duì) YAP-AREG 軸的影響，將 IL-17A 連續(xù) 6 天注射到小鼠左耳皮下（右耳接受 PBS 作為對(duì)照）。盡管在 IL-17A 處理的耳朵中沒有觀察到明顯的外部表型，但與右耳相比，IL-17A 處理的耳朵的厚度顯著增加（圖 e - g）。重要的是，IL-17A 處理導(dǎo)致 Mki67 和 AREG 的表達(dá)顯著增加（圖 h-i），并降低了磷酸化 YAP 的水平并提高了耳表皮中的總 YAP 水平（圖 j）。

這些結(jié)果表明，在 IMQ 治療的小鼠模型中，IL-17A 誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞（KCs）過度增殖且伴隨著 YAP-AREG 通路的激活。

圖2 | YAP-AREG 信號(hào)在 IL-17A 作為其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的 IMQ 誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中升高

IL-17A 通過激活 HaCaT 細(xì)胞中的 Hippo-YAP 信號(hào)增強(qiáng) AREG 表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步研究 IL-17A 對(duì) Hippo YAP 信號(hào)傳導(dǎo)的影響，用 IL-17A 刺激 HaCaT 細(xì)胞、NHEK 細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增殖標(biāo)記物 MKI67 水平升高，而分化標(biāo)記物（FLG、IVL、LOR、KRT1和KRT10）表達(dá)水平則下調(diào)（圖 a）。值得注意的是，在 IL-17AEA 處理的 HaCaT 細(xì)胞中，AREG 表達(dá)水平和培養(yǎng)上清液濃度顯著增加（圖 b-c）。細(xì)胞計(jì)數(shù)分析表明，IL-17A 促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞的增殖，小干擾 RNA（siRNA）介導(dǎo)的 AREG 沉默基本上消除了這種效應(yīng)（圖 d）。因此，IL-17A 的 KCs 增殖增強(qiáng)作用依賴于 AREG。

此外，為了檢測(cè) IL-17A 是否改變 HaCaT 細(xì)胞中的 YAP 信號(hào)，作者通過 WB 分析、免疫印跡、免疫熒光分析和共免疫沉淀等分析，結(jié)果表明 IL-17A 能夠激活 Hippo-YAP 信號(hào)通路，抑制 YAP 的降解，促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi) YAP 的分布以及與轉(zhuǎn)錄因子 TEAD4 的相互作用，最終上調(diào)效應(yīng)分子 AREG 的表達(dá)和分泌（圖 e-l）。

總之，這些結(jié)果證明了 IL-17A 通過激活 HaCaT 細(xì)胞中的 Hippo-YAP 信號(hào)來增強(qiáng) AREG 表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖3 | IL-17A 通過 Hippo-YAP 通路上調(diào) AREG 表達(dá)并促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖

沉默 ACT1 能夠阻斷 IL-17A 對(duì)于 YAP-AREG 信號(hào)的調(diào)控作用

ACT1 是已知的 IL-17R 信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)適配器，為了探索 ACT1 在 IL-17A 促進(jìn) AREG 表達(dá)和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中的作用，作者通過沉默 ACT1 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn) AREG 的表達(dá)和分泌上調(diào)，以及IL-17A處理后細(xì)胞增殖的上調(diào)，在很大程度上被 ACT1 缺失逆轉(zhuǎn)（圖 a-h）。為了確定 ACT1 是否參與了 IL-17A 誘導(dǎo)的 Hippo-YAP 信號(hào)的激活，作者通過檢測(cè)關(guān)鍵信號(hào)成分的水平和磷酸化水平，在 HaCaT 和 NHEK 細(xì)胞中，ACT1 敲除使 IL-17AE 誘導(dǎo)的磷酸化 YAP 和 MST1/2 的減少被逆轉(zhuǎn)，并阻斷 IL-17A 誘導(dǎo)的 YAP 核積累上調(diào)（圖 i - m）。值得注意的是，ACT1 缺失也消除了 IL17A 誘導(dǎo)的 YAP 和 TEAD4 之間的相互作用（圖 n）。

圖4 | 沉默 ACT1 能夠阻斷 IL-17A 對(duì)于 YAP-AREG 信號(hào)的調(diào)控作用

IL-17A 通過將 MST1 招募到 ACT1 來激活 YAP 信號(hào)

為了闡明 IL-17A 激活 YAP 信號(hào)的分子機(jī)制，通過共免疫沉淀分析、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因敲除等實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證 ACT1 可以在 IL-17A 存在的情況下直接招募 MST1 的假設(shè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17A 刺激 HaCaT 細(xì)胞導(dǎo)致 ACT1 和 MST1 之間的相互作用短暫增強(qiáng)，而 MST1 和 LATS1 之間的相互作用明顯受損，IL-17A增強(qiáng)了 HA 標(biāo)記的 MST1 和 His 標(biāo)記的 ACT1 之間的相互作用，但減弱了 HA 標(biāo)記的MST1和LATS1之間的相互作用，被 IL-17A 處理削弱的 MST11 相互作用可以通過 ACT1 缺失得以恢復(fù)（圖 a-c）。

這些結(jié)果揭示了以往未有報(bào)道的 IL-17Rs 信號(hào)適配器ACT1 和 Hippo 信號(hào)之間的相互作用。研究表明，IL-17A 可能通過將 MST1 招募到 ACT1 并破壞 Hippo 信號(hào)的磷酸化來激活 Hippo-YAP 信號(hào)。

圖5 | IL-17A 通過招募 MST1 至 ACT1 進(jìn)而激活 Hippo-YAP 信號(hào)通路

研究結(jié)論

(1)本研究結(jié)果表明銀屑病中 IL-17A 通過 ACT1 激活 Hippo-YAP 信號(hào)通路，啟動(dòng) AREG 的表達(dá)分泌，最終促進(jìn)了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和表皮增厚過程。

(2)本研究為銀屑病中 IL-17A 促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并引起表皮異常增厚的臨床現(xiàn)象提供了科學(xué)的分子機(jī)制解釋。

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院余增洋博士、于倩博士和許輝博士為共同第一作者。文章中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析服務(wù)由歐易生物完成。

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