ARMS-PCR

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR （Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）是Newton等首先建立用來(lái)檢測(cè)已知突變的方法。

ARMS基本原理

如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般耐熱DNA聚合酶無(wú)法延伸。因此根據(jù)已知點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)2條引物，其3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補(bǔ)，從而將有某種點(diǎn)突變的模板與正常模板區(qū)分開(kāi)來(lái)。此法已用于多種疾病的點(diǎn)突變的檢測(cè)。

我們都清楚ARMS的簡(jiǎn)單原理，即理論上Taq DNA聚合酶必須在引物3’末端堿基與模板完全互補(bǔ)情況下才能進(jìn)行有效的聚合反應(yīng)，但由于Taq DNA嚴(yán)謹(jǐn)性受多因素影響，某些情況下，即使引物的3’末端堿基與模板不互補(bǔ)，延伸仍然可以進(jìn)行（如果3′末端只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，那么是引物是可以錯(cuò)配結(jié)合的并可以進(jìn)行延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配對(duì)的引物），而且不同的3’末端錯(cuò)位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引入了其他的錯(cuò)配堿基，那么錯(cuò)配的數(shù)目太多或達(dá)到一定程度，那么3′末端無(wú)法進(jìn)行延伸），因而僅靠引物3’末端一個(gè)堿基的錯(cuò)配不能充分而可靠地區(qū)分兩個(gè)等位基因，進(jìn)而造成假陽(yáng)性結(jié)果。

如何提高引物延伸的特異性呢？

通過(guò)人為地使引物3′末端的第二個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配來(lái)提高引物延伸的特異性防止發(fā)生錯(cuò)配，TaqDNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性,因此對(duì)于3′末端錯(cuò)配的引物,以低于正常末端配對(duì)引物的速度延伸,當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí), 3′末端堿基則因磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸,反應(yīng)終止,也就得不到特異長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶,從而表明模板DNA沒(méi)有與引物3′末端相應(yīng)的突變;如果PCR結(jié)果能得到特異長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶,表明模板DNA上具有與引物3′末端相應(yīng)的突變。

但引物3′末端的第二個(gè)堿基具體突變成哪個(gè)堿基這個(gè)選擇可是大有學(xué)問(wèn)的：為了提高反應(yīng)的特異性，在倒數(shù)第二個(gè)堿基處引入了一個(gè)故意的錯(cuò)配。舉一個(gè)例子讓大家更好的了解這個(gè)故意的錯(cuò)配應(yīng)該選擇哪個(gè)堿基。根據(jù)下圖，我們首先考慮野生型引物與WP-MT的情況，其中WT和MT的1號(hào)位T/G表現(xiàn)出弱不穩(wěn)定錯(cuò)配（黃色）。然后我們看倒數(shù)第二個(gè)位置來(lái)觀察模板序列上的堿基，在這種情況下是G。根據(jù)圖中所示，在兩個(gè)AS引物中，只有核苷酸A應(yīng)該放在3號(hào)位末端堿基旁邊，以確保更強(qiáng)的不穩(wěn)定。

優(yōu) 點(diǎn)

1. 操作簡(jiǎn)單；時(shí)間快速；靈敏度高，可檢測(cè)低至1%的突變

2. 只有一次開(kāi)蓋過(guò)程，有效防止污染

3. 整個(gè)操作只需Real-time PCR儀

4. 成本較低

缺 點(diǎn)

1. 通量較低，無(wú)法在單次運(yùn)行中檢測(cè)到數(shù)千個(gè) SNP??最后

2. 不能檢測(cè)未知突變，而 ARMS-PCR 的局限性包括未檢測(cè)到缺失/其他主要重復(fù)和染色體異常

3. 不適于位點(diǎn)附近GC含量過(guò)高或過(guò)低的SNP的分型檢測(cè)。如果 PCR 中沒(méi)有內(nèi)部控制，或者 PCR 循環(huán)期間溫度波動(dòng)，則存在假陰性結(jié)果。

此方法適宜于對(duì)通量要求不高的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行突變檢測(cè)，特別是體細(xì)胞突變

作者：海星生物

公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因敲除

以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服務(wù)內(nèi)容：CRISPR/Cas9細(xì)胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動(dòng)物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 干細(xì)胞/原代細(xì)胞 培養(yǎng)試劑盒