CHO細(xì)胞歷史悠久，并擁有龐大的家族。從1919年，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的Dr. E.T. Hsieh 在北京郊外抓了一些中國(guó)倉(cāng)鼠用作動(dòng)物模型開(kāi)始，一直到1948年12月，由美國(guó)醫(yī)生Robert Briggs Watson在協(xié)和醫(yī)學(xué)院的Cheng siang-Hu教授的協(xié)助下將20只中國(guó)倉(cāng)鼠趕在南京解放前送到上海，并從上海運(yùn)送到紐約，最后由Victor Schwentker公司馴養(yǎng)成一種實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物品系，中國(guó)倉(cāng)鼠一直作為一種實(shí)驗(yàn)室研究用動(dòng)物模型（想到這里筆者痛心疾首，要不是那時(shí)中國(guó)處于戰(zhàn)亂，自己沒(méi)有能力保存，也不至于今天被ATCC和ECACC掐住脖子）。后Puck成功分離到了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞并體外培養(yǎng)，在接下來(lái)的幾十年里CHO細(xì)胞家族不斷壯大，被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。
CHO細(xì)胞品系的歷史

細(xì)胞株開(kāi)發(fā)常用的CHO細(xì)胞：DG44, DUXB11, CHO-S, CHO-K1 WT, CHO-K1 GS-/-

不同的宿主細(xì)胞在細(xì)胞株構(gòu)建中的表現(xiàn)差異很大，本文僅能從筆者有限的經(jīng)驗(yàn)中提供一些參考，對(duì)于初步涉及細(xì)胞株工作的朋友，可以采購(gòu)商品化的宿主細(xì)胞試劑盒，并遵照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，熟悉細(xì)胞的特性后，再自行優(yōu)化篩選方式。各種宿主細(xì)胞均有各自?xún)?yōu)劣，使用者需要考慮包括表達(dá)水平、蛋白質(zhì)量、商業(yè)授權(quán)等各方面因素，例如優(yōu)勢(shì)方面，GS系統(tǒng)下表達(dá)量和Qp相對(duì)較高，DG44系統(tǒng)細(xì)胞株穩(wěn)定性好，K1 篩選周期短且表達(dá)量高，CHO-S商業(yè)授權(quán)清晰；反過(guò)來(lái)缺點(diǎn)方面GS系統(tǒng)價(jià)格昂貴，DG44表達(dá)量較低，K1細(xì)胞株穩(wěn)定性較差，CHO-S相對(duì)易結(jié)團(tuán)等等。真正有經(jīng)驗(yàn)的研究人員，則可以根據(jù)不同細(xì)胞的特性，開(kāi)發(fā)合適的篩選方式和培養(yǎng)工藝，將細(xì)胞的潛能挖掘到最大，正如俗語(yǔ)所說(shuō)“Less is more”，細(xì)胞株構(gòu)建亦然。

常用商業(yè)化宿主細(xì)胞株

穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建流程

1、將表達(dá)抗體的目的基因構(gòu)建到載體上，再將該載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)染方式主要有鈣轉(zhuǎn)、電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核后將會(huì)隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組當(dāng)中去，因此表達(dá)水平與基因拷貝數(shù)、基因整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。

2、接下來(lái)不同篩選試劑將被用于篩選能夠正確表達(dá)目的基因并且高水平表達(dá)的細(xì)胞群(pool）。

3、由于此時(shí)得到的細(xì)胞群中的每個(gè)細(xì)胞特性各異，具有不同的基因整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)、細(xì)胞單產(chǎn)和生長(zhǎng)速率，因此需要將其中具有高產(chǎn)、穩(wěn)定表達(dá)特性的細(xì)胞個(gè)體分離出來(lái)分別培養(yǎng)，通常需要獲得數(shù)百甚至上千的候選克隆供進(jìn)一步篩選。

4、被篩選出來(lái)的克隆經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)和分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)(Fed-batch)，比較其生長(zhǎng)特性、代謝狀況、表達(dá)量高低、表達(dá)產(chǎn)物質(zhì)量等，選出最優(yōu)的幾個(gè)克隆進(jìn)入生物反應(yīng)器放大實(shí)驗(yàn)，同步評(píng)估細(xì)胞株穩(wěn)定性，最終確定生產(chǎn)用單克隆細(xì)胞株。

細(xì)胞株構(gòu)建流程圖(以GS系統(tǒng)為例)

篩選標(biāo)記

為了有效地篩選出高表達(dá)的細(xì)胞，表達(dá)載體上除了包含抗體的重、輕鏈以外，往往還含有各種篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記一般可以被分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是以G418為代表的抗生素類(lèi)篩選標(biāo)記，另一類(lèi)是以MTX為代表的影響細(xì)胞代謝的篩選標(biāo)記。與此同時(shí)，高效的啟動(dòng)子（如CMV）和延長(zhǎng)因子（如EF1α）被廣泛運(yùn)用于抗體表達(dá)載體。翻譯的起始位置是恒定的Kozak序列：GCC GCC（A/C）CC和抗體特異性的信號(hào)肽——不同的重輕鏈類(lèi)型有各自特異的信號(hào)肽序列。

常用篩選標(biāo)記

位置效應(yīng)

插入染色體的位置影響真核基因的表達(dá)，即“位置效應(yīng)”。當(dāng)外源基因插入異染色質(zhì)及其附近區(qū)域產(chǎn)生位置效應(yīng)時(shí)，此處異染色質(zhì)區(qū)域?qū)a(chǎn)生位置效應(yīng)斑點(diǎn)，此時(shí)，周?chē)漠惾旧|(zhì)將有效地阻止插入基因的表達(dá)。為了克服“位置效應(yīng)”，一般有兩種辦法：

1、將目的基因定點(diǎn)整合到合適的位點(diǎn)；

2、在目的基因的側(cè)翼加上“絕緣子”DNA序列，從而抑制“位置效應(yīng)”。

細(xì)胞群

當(dāng)目的基因被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)，并按照一定的細(xì)胞密度在合適的篩選壓力下進(jìn)行傳代培養(yǎng)后便得到了細(xì)胞群（pool）。細(xì)胞群的表達(dá)量取決于轉(zhuǎn)染的方式、篩選壓力的作用以及目的基因整合情況 。由于不同的宿主細(xì)胞在篩選條件下的特性不同，針對(duì)不同的宿主細(xì)胞，可以采取不同的細(xì)胞群篩選方式，包括是搖瓶中大規(guī)模的細(xì)胞群的篩選還是孔版中的迷你細(xì)胞群的篩選，亦或是選擇合適的篩選壓力大小，目標(biāo)是在較短的時(shí)間內(nèi)能夠篩選得到表達(dá)量相對(duì)較高的細(xì)胞群。對(duì)于不同的項(xiàng)目，在細(xì)胞群階段需要考察的標(biāo)準(zhǔn)不同，對(duì)于常規(guī)新藥抗體，往往表達(dá)量會(huì)成為第一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于生物類(lèi)似物，則需在細(xì)胞群階段著重考察各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)與原研的差異；對(duì)于雙特異性抗體，則需要在此階段就開(kāi)始考察正確裝配的比例，從而降低克隆篩選階段的風(fēng)險(xiǎn)。

常用的篩選克隆的方法

1. 有限稀釋法（Limiting dilution cloning，LDC）：因?yàn)槠涞统杀竞鸵子诓僮?，被廣泛運(yùn)用于克隆的篩選。需要注意的是，為符合FDA的申報(bào)要求需進(jìn)行兩輪LDC，且細(xì)胞密度<0.5細(xì)胞每孔或者一輪LDC結(jié)合圖像證明，以驗(yàn)證單克隆性。有限稀釋法工作量大，往往需要運(yùn)用自動(dòng)化工作站進(jìn)行高通量的篩選。

2. 半固體培養(yǎng)基法進(jìn)行單克隆的篩選：細(xì)胞生長(zhǎng)在半固體培養(yǎng)中，形成單克隆細(xì)胞團(tuán)，同時(shí)將抗體分泌在細(xì)胞團(tuán)周?chē)?，半固體培養(yǎng)基中含有熒光標(biāo)記的二抗，能與抗體Fc片段特異性結(jié)合，當(dāng)用一定波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)時(shí)就能發(fā)出熒光。使用圖像分析軟件能夠?qū)慰寺〖?xì)胞團(tuán)的大小、熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，從而篩選出生長(zhǎng)旺盛、表達(dá)量高的單克隆細(xì)胞團(tuán)。自動(dòng)化的機(jī)械臂能夠按照實(shí)驗(yàn)人員設(shè)定的參數(shù)將符合要求的細(xì)胞團(tuán)挑取出來(lái)用于后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)。半固體培養(yǎng)基法能夠通過(guò)自動(dòng)化的方式挑取單克隆細(xì)胞，大大減輕了實(shí)驗(yàn)人員的工作負(fù)擔(dān)，但用于熒光掃描、圖像分析和克隆挑取的機(jī)器價(jià)格昂貴，且為符合申報(bào)要求，需要兩輪半固體培養(yǎng)基篩選或一輪半固體培養(yǎng)基篩選結(jié)合一輪LDC進(jìn)行。

3. 流式細(xì)胞儀分選法（FACS）：將帶有熒光標(biāo)記的二抗和分泌抗體的CHO細(xì)胞混合孵育，分泌到細(xì)胞表面的抗體就能夠被流式細(xì)胞儀檢測(cè)到，從而利用其分選功能篩選出分泌多的細(xì)胞。為了使分泌到胞外的抗體能夠維持在細(xì)胞膜表面，還可以使用微囊將細(xì)胞以及分泌的抗體包裹起來(lái)。

克隆篩選工作往是微量、高通量，檢測(cè)和操作手段的改善和升級(jí)非常重要，如HTRF（均相時(shí)間分辨熒光），可以使用較小的樣品量（2.5-5.0μL）進(jìn)行高通量（384孔板）檢測(cè)，結(jié)合自動(dòng)化工作站的輔助，能夠大幅降低研發(fā)人員的工作量。

優(yōu)秀的單克隆細(xì)胞株還要考慮到細(xì)胞生長(zhǎng)、表達(dá)和代謝情況，以及目的蛋白的質(zhì)量水平。要關(guān)注乳酸和氧的代謝，高乳酸和高耗氧可能為細(xì)胞株在反應(yīng)器的培養(yǎng)埋下隱患。細(xì)胞株的工藝要考慮到未來(lái)反應(yīng)器中培養(yǎng)的可重復(fù)和可放大性，同時(shí)選擇可及性較強(qiáng)，批次穩(wěn)定的培養(yǎng)基和補(bǔ)料。

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