免疫沉淀之RNA免疫共沉淀
? 前幾期干貨介紹了研究蛋白與蛋白之間互作的Co-IP、蛋白與DNA之間互作的ChIP，這些都是研究蛋白與生物大分子互作的經(jīng)典且有效的方法，涉及相關(guān)實(shí)驗(yàn)的小伙伴可以往前幾期學(xué)習(xí)下哦！依此看，蛋白質(zhì)與RNA之間的互作是不是也有類似的研究方法？答案是肯定的，即RNA免疫共沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）技術(shù)。? ? ??
? ? ? ?在原理上，RIP與ChIP非常相似，可以理解為只是研究對象不同，RIP主要是研究蛋白-RNA間的互作情況。這些RNA可以是mRNA、非編碼RNA甚至病毒RNA等。在實(shí)驗(yàn)方案和步驟上，RIP也有自身特別需要注意的地方，后面將會(huì)一一介紹。
?????? RIP實(shí)驗(yàn)可根據(jù)目的分為兩種情況，一種是探索性實(shí)驗(yàn)，另一種是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。具體講，第一種是靶RNA未知、已知RBP的情況下，為了探尋與RBP結(jié)合的潛在RNA，一般是將RIP中分離得到的RNA進(jìn)行高通量測序分析，鑒定出所有結(jié)合的RNA，并從中篩選出感興趣的候選RNA。第二種驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，則是已知靶RNA和RBP，通過qPCR對靶RNA產(chǎn)物進(jìn)行定量、鑒定等分析。當(dāng)然，可以將探索和驗(yàn)證視為整體的實(shí)驗(yàn)，即先尋找、篩選出候選RNA，接著再進(jìn)一步驗(yàn)證候選RNA與RBP的關(guān)系。實(shí)際上，這一思路對于Co-IP和ChIP等實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)是通用的。
?????? 總的來說，RIP可用于研究活細(xì)胞中RNA與蛋白的互作關(guān)系，揭示RNA的功能機(jī)制以及RBP從中起到的作用，進(jìn)而參與生理或病理過程。RNA表觀遺傳學(xué)修飾是近年來研究的熱門課題，通過RIP結(jié)合qPCR（即RIP-qPCR）可研究表遺傳修飾酶與RNA之間的關(guān)系，并鑒定靶RNA的表觀遺傳修飾方式以及定量修飾水平，當(dāng)然也可以通過WB對修飾酶（或其他RBP）進(jìn)行鑒定分析。另外，RIP還可用于繪制全基因組RNA與RBP互作圖譜。
RIP基本原理：
?????? RIP在非變性條件下裂解細(xì)胞以保留蛋白-RNA之間的相互作用關(guān)系。在細(xì)胞裂解液中加入目的蛋白抗體進(jìn)行孵育，然后再加入固定在磁珠、能與目的蛋白抗體特異性結(jié)合的protein A/G，通過免疫沉淀后得到‘RNA-目的蛋白-目的蛋白抗體-protein A/G-磁珠’復(fù)合物，也就是分離出細(xì)胞中目的蛋白與RNA的復(fù)合物，再進(jìn)一步將沉淀復(fù)合物進(jìn)行分離純化，即可得到其中結(jié)合的RNA，最后結(jié)合qPCR或高通量測序（RIP-seq）等方法來鑒定RNA。
圖1 RIP示意圖[1]
RIP一般實(shí)驗(yàn)方案和步驟：
?????? 這里主要是總結(jié)下基本的實(shí)驗(yàn)過程，具體操作細(xì)節(jié)可按照所使用試劑盒的說明書執(zhí)行。
（1）收集細(xì)胞并裂解
?????? 將一定密度的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的清洗、消化、離心收集至EP管中。如果需要用甲醛進(jìn)行交聯(lián)固定，則先固定后收集，操作和目的與ChIP的固定一樣。接著使用新鮮配置的RIP裂解緩沖液裂解重懸細(xì)胞，置于冰上裂解5 min。注意留出少量裂解液作為對照Input。細(xì)胞裂解液可儲存于-80℃數(shù)月。
（2）RNA免疫沉淀
① 重懸、制備磁珠，根據(jù)具體使用說明制備protein A/G磁珠，取一定量的磁珠于EP管中，用RIP洗滌緩沖液進(jìn)行渦旋振蕩后棄上清，重復(fù)2-3次；
② 將目的蛋白抗體加入細(xì)胞裂解液中，4℃搖床孵育2小時(shí)至過夜；
③ 將制備好的protein A/G磁珠加入抗體孵育后的樣品中，4℃搖床孵育1小時(shí)。
（3）洗滌、純化RNA
① 將上一步的沉淀復(fù)合物進(jìn)行離心沉淀，用RIP洗滌緩沖液重懸沉淀，再離心收集，重復(fù)6次；
② 取適量蛋白酶K緩沖液重懸沉底復(fù)合物，55℃孵育30min；
③ 加入1 mL trizol以分離提取復(fù)合物中的RNA；若收集細(xì)胞時(shí)做了交聯(lián)固定，此時(shí)需要先解交聯(lián)后提取RNA；
④ 使用不含核酸酶的DEPC水洗脫RNA。
（4）分析鑒定
?????? 將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。若已知靶RNA，使用qPCR分析；若是靶RNA未知，則使用微陣列和測序分析。
RIP實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
（1）最重要的一點(diǎn)是，RIP實(shí)驗(yàn)過程中所涉及的所有試劑、抗體、容器及耗材都不能含有RNA酶；
（2）實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該設(shè)置一個(gè)或多個(gè)陰性對照實(shí)驗(yàn)，以排除假陽性結(jié)果；
（3）如果需要使用甲醛交聯(lián)固定，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳的交聯(lián)時(shí)間；
（4）可用于IP的抗體也可以用于RIP，抗體用量和孵育時(shí)間可能也需要摸索最佳條件；
（5）若一開始對蛋白-RNA進(jìn)行交聯(lián)固定，后續(xù)提取RNA前需要記得先解交聯(lián)；
（6）為降低背景，應(yīng)使用RIP洗滌緩沖液多次、充分洗滌免疫沉淀復(fù)合物；
（7）需確保足量的蛋白水平，目的蛋白表達(dá)水平低時(shí)，可能分離得到的RNA較少，可通過外源性過表達(dá)目的蛋白，以提高表達(dá)水平，進(jìn)而獲得足量的靶RNA。
（8）若是目的蛋白比較特殊還沒有合適的特異性抗體，可以通過與標(biāo)簽融合表達(dá)，使用標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫沉淀。
?????? 本期關(guān)于RIP相關(guān)內(nèi)容就介紹完了，特別要注意的實(shí)驗(yàn)步驟是一般的實(shí)驗(yàn)方案參考，具體細(xì)節(jié)需小伙伴們做實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)自己的條件進(jìn)行優(yōu)化。至此，我們介紹了IP、Co-IP、ChIP、RIP這一系列的免疫沉淀技術(shù)，它們的基本原理都是基于抗原-抗體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，然后根據(jù)研究對象的不同，細(xì)分出了不同的方法。除此之外，有時(shí)候我們還會(huì)見到pull-down實(shí)驗(yàn)，例如GST pull-down、RNA pull-down，這種又是什么實(shí)驗(yàn)？跟前面介紹的幾種免疫沉淀又有什么聯(lián)系和區(qū)別呢？下期我們繼續(xù)聊聊這些問題，敬請期待。
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參考文獻(xiàn)：
[1] Gagliardi M, Matarazzo MR. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2016;1480:73-86. doi: 10.1007/978-1-4939-6380-5_7.
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