RNA-DNA雜交在哺乳動物基因組中很常見，包括在DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程中形成的雜交。然而，當RNA堿基對與其同源的DNA位點配對時，可形成三鏈核酸結(jié)構(gòu)的R-loop，從而取代單鏈DNA環(huán)(ssDNA)。這種R-loop介導的DNA突變很廣泛，表現(xiàn)為堿基切除修復引起的雙鏈DNA斷裂(DSBs),介導基因組失衡，可在活化B細胞的免疫球蛋白類開關(guān)重組(CSR)中發(fā)揮作用?？梢韵胂?，異常的R-loop可以誘發(fā)致癌突變，引起癌癥發(fā)生。

在所有癌癥類型中，急性白血病突變率最低，平均每兆酶少于0.5個突變。H3K4組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶混合譜系白血病(MLL，也稱為KMT2A)基因染色體易位在急性白血病患者中約占5%-10%，但在嬰兒白血病患者中占比高達70%以上。這些易位伴侶基因譜，被稱為MLL重組體。大多數(shù)MLL易位定位于8.3kb的斷點簇區(qū)(bcr)，包括MLL的內(nèi)含子5-12及其伴侶基因內(nèi)含子的共同位點。但是易位產(chǎn)生的機制以及它如何與伴侶基因融合仍有待充分闡明，了解這些MLL重組對于預防白血病至關(guān)重要。

2023年6月，弗林德斯癌癥創(chuàng)新中心的Simon Conn教授和Vanessa Conn博士團隊在世界頂級癌癥期刊之一的Cancer Cell（IF=38.585）上發(fā)表重磅文章Circular RNAs drive oncogenic chromosomal translocations within the MLL recombinome in leukemia。作者發(fā)現(xiàn)circRNA(circRNAs)在MLL重組體中富集，可結(jié)合DNA并在其同源位點形成circRNA-DNA雜交體(circR-loop)。這些circR-loop促進轉(zhuǎn)錄暫停、蛋白酶體抑制、染色質(zhì)重組和DNA斷裂。重要的是，在小鼠白血病異種移植模型中過表達circRNA會導致基因組的共定位（MLL重組體的染色體易位），從而誘發(fā)疾病。這些研究結(jié)果解析了白血病中內(nèi)源性RNA染色體易位機制。

circR-loop在人類基因組中普遍存在，在MLL重組體內(nèi)富集

為了評估circRNAs在人類細胞全基因組中形成R-loop的能力，作者對HEK293T細胞進行了DRIP-seq，確定了20,467個離散的R-loop。通過將R-loop與相匹配的核分數(shù)circRNA測序（circRNA-seq）進行交叉比對(藍色條)，在核部分鑒定出11035個獨特的circRNA(細胞質(zhì)部分鑒定出60009個circRNA)，其中1279個與R-loop峰重疊，以下稱為circR-loop(紫色條)。circR-loop組約占所有檢測到的R-loop的6%。

在MLL重組體中，作者發(fā)現(xiàn)含circRNA的基因在HEK293T細胞中高度富集（61個表達基因中56個含circRNA的基因=91.8%）、急性早幼粒細胞白血病細胞（71.4%）、ALL（60.5%）和非白血病mesHMLE細胞（80%）。

circMLL形成R-loop的量化和可視化以及誘發(fā)轉(zhuǎn)錄暫停

為了評估MLL重組體下circR-loop導致染色體易位的可行性，作者在HEK293T細胞中過表達完全包含在MLL中的circRNAs(circMLL(9,10)和circMLL(12))及其共同伴侶基因MLLT1(circMLLT1(2))，并進行了DRIP-seq（特異識別DNA）。對于所有circRNA，在MLL和MLLT1的同源外顯子上都可以看到DRIP峰。在雜交程度增加的情況下使用R-loop特異性S9.6抗體進行點印跡定量，發(fā)現(xiàn)circRNA在低雜交狀態(tài)下形成R-loop的能力就強于線性RNA。這一結(jié)果證明了circRNA對同源DNA具有很高的親和力。

為了直觀地驗證circR-loop的形成，作者使用單個RNA探針靶向circMLL的后剪接連接(9,10)和DNA探針靶向MLL基因組DNA位點，進行了三維RNA-DNA熒光原位雜交(3D RNA/DNA-FISH)。在3D RNA/DNA-FISH之前，用空載體(pcDNA3.1)或circMLL(9,10)過表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。在對照細胞系中沒有發(fā)現(xiàn)信號；在circMLL(9,10)過表達細胞系中，細胞核DAPI染色發(fā)現(xiàn)一到兩個離散信號。circMLL(9,10)信號總是與MLL gDNA基因信號共定位，表明circMLL(9,10)與其同源基因組位點在物理上、核上共定位。

通過轉(zhuǎn)錄物分析，將對照和MLLr白血病進行分層，qRT-PCR來量化circRNA。與對照組相比，MLLr白血病患者樣本中circRNA的豐度高出100倍以上。為了研究circR-loop是否促進轉(zhuǎn)錄暫停，作者從已發(fā)表的HEK293T NET-seq數(shù)據(jù)中檢測了RNAPII占用率，該分析發(fā)現(xiàn)，與同一基因內(nèi)的其他外顯子相比，RNAPII在circR-loop附近(包括上游和下游內(nèi)含子)富集，但在500個最豐富的circRNA中，和在與先前公布的HEK293T細胞的circRNA數(shù)據(jù)集相對應的部位，則沒有這種情況。這表明RNAPII暫停在circR-loop附近富集，并不是circRNA轉(zhuǎn)錄的普遍特征。

circR-loop引起雙鏈DNA斷裂（DSBs）

為評估circR-loop是否與染色體易位相關(guān)，作者將circR-loop與全基因組的DSBs相關(guān)聯(lián)。利用來自野生型HEK293T細胞公開的BLESS(斷裂標記、鏈親和素富集和下一代測序)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與豐度最高、核定位的circRNAs相比，靠近circR-loop的DSBs的發(fā)生率增加。

接著，作者通過單獨和聯(lián)合表達circMLL(9,10)和circMLLT1(2)來分析候選circRNAs在其同源基因座上驅(qū)動特定DSBs的能力，這兩種RNA都形成精確、穩(wěn)定的circR-loop，在HEK293T細胞中表達FLAG標記的AID或缺乏胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域(AIDΔ58-94或mutAID)的催化死亡陰性對照AID蛋白。通過執(zhí)行BLESS的更可擴展的版本（原位斷裂標記和測序），作者發(fā)現(xiàn)在AID存在的情況下，MLL和MLLT1中circR-loop相鄰的內(nèi)含子中DSBs形成增加，但與mutAID共同表達時或過量表達circSMARCA5（15,16）時，盡管先前在該部位發(fā)現(xiàn)了一個circR-loop，但沒有明顯的DSBs。

作者在circMLL(9,10)(平均病灶/細胞=7.2)瞬時過表達后，觀察到核γH2A.X信號的增加，一種已知的DNA損傷標志物，而沒有在circSMARCA5(15,16)(平均病灶/細胞=0.2)中觀察到。這表明circMLL(9,10)介導的效應不是MLL位點特異性的，而是更廣泛地影響基因組。有趣的是，隨著circMLL(9,10)的共同表達，MLLT1內(nèi)含子的DSBs數(shù)量增加了10倍，這進一步表明circMLL(9,10)的表達可誘發(fā)DSBs。

circMLL(9,10)與蛋白酶體相互作用并抑制蛋白酶體的成分

為了深入了解circMLL(9,10)暫停RNAPII并在同源和伴侶位點引起DSBs的能力機制，作者進行了circRNA免疫沉淀來分析circMLL(9,10)的蛋白質(zhì)相互作用。KEGG分析發(fā)現(xiàn)蛋白酶體是最豐富的功能類別物。雖然每個蛋白都是較大的26S蛋白酶體的成分，但催化核心亞基20S蛋白酶體的14個亞基中有5個被circMLL(9,10)結(jié)合。

作者接著在HEK293T細胞中與circMLL共表達帶有FLAG標記的2型蛋白酶體(PSMA2)(9,10)，通過RNA免疫沉淀(RIP)后的western blotting成功地富集了PSMA2-FLAG。circMLL(9,10)的qRT-PCR實驗表明，PSMA2和circMLL(9,10)之間存在相互作用。

通過慢病毒轉(zhuǎn)染制備穩(wěn)定細胞系，分析三種主要的蛋白酶體活性（凝乳胰蛋白酶樣、胰蛋白酶樣和caspase樣）。用5mM的環(huán)氧霉素(Epoxomicin)作為對照蛋白酶體抑制劑，可顯著降低所有蛋白酶的活性。與空載體對照細胞系相比，單獨或與circMLLT1(2)聯(lián)合過量表達circMLL(9,10)，導致凝乳胰蛋白酶樣活性有統(tǒng)計學意義的下降。然而，單獨過表達circMLLT1(2)并不會改變凝乳胰蛋白酶樣、胰蛋白酶樣或caspase樣蛋白酶體的活性。這表明circMLL(9,10)存在時細胞蛋白酶體活性降低。此外作者亦發(fā)現(xiàn)，circMLL(9,10)能夠直接抑制20S蛋白酶體活性。

circRNAs在體內(nèi)外驅(qū)動致癌易位，加速小鼠白血病的發(fā)生

作者為了評估這些circRNAs誘導全基因組DSBs的能力，通過單獨或聯(lián)合過表達circMLL(9,10)和circMLLT1(2)的穩(wěn)定HL-60細胞系，采用中性彗星試驗進行研究。結(jié)果表明，根據(jù)尾矩測量，與空載體相比，circMLL(9,10)、circMLL(9,10)/circMLLT1(2)和circMLLT1(2)細胞系的DSBs數(shù)量明顯增加，其中circMLLT1(2)細胞與circMLL(9,10)表達系相比，增幅最小。紫外線照射HL-60 EV細胞作為陽性對照，顯示出最大的尾矩（大約比EV高14倍）。對這些細胞系進行RNA測序，并使用STAR-fusion和clinker軟件檢測融合轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)涉及MLL基因的染色體易位僅在circMLL(9,10)表達細胞系中可見。這些實驗證明了circRNA驅(qū)動MLL重組體內(nèi)精確的致癌易位。

接下來，作者通過空載體對照、單個circMLL(9,10)和circMLLT1(2)，或雙circRNA過表達(circMLL(9,10)/circMLLT1(2))細胞異種移植到免疫功能低下的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid gamma)小鼠中，評估了circRNA過表達在體內(nèi)的影響。Kaplan-Meier生存分析表明，與空載體對照相比，單獨circRNA的過表達對這些小鼠的疾病發(fā)作沒有顯著影響；雙過表達系顯示出明顯的疾病加速(p=0.04,log rank Mantel-Cox檢驗)。重要的是，作者使用MLL-MLLT1基因組DNA探針通過DNA-FISH證實，在circMLL(9,10)/circMLLT1(2)系中可以看到獨特的融合。

眾所周知，AML是所有癌癥中突變負擔最低的，對AML的關(guān)注闡明了circRNAs在驅(qū)動這些常見且預后不佳的MLL易位中的致癌作用。而內(nèi)源性RNA導致的DNA損傷（染色體易位）是驅(qū)動白血病的腫瘤發(fā)生和疾病侵襲性的體內(nèi)證據(jù)。這代表了一種以前未知的、基于基因組失衡的腫瘤發(fā)生機制，其普遍性可能更加廣泛，可能對更廣泛地了解基因組突變至關(guān)重要，并可作為治療的一個新靶標。

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https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.05.002