如何制作PCR引物

2022-11-04 13:42 作者:biofount科研試劑 0人讀過(guò) | 我要投稿

為了擴(kuò)增基因組中的特定DNA片段，該特定DNA片段的兩側(cè)應(yīng)同時(shí)具有正向和反向引物。因此，兩種引物都應(yīng)該與DNA片段兩側(cè)的序列互補(bǔ)。成功設(shè)計(jì)PCR引物的基本指南如下所述。

正向和反向引物的方向應(yīng)為 5' 至 3'。
每個(gè)引物的長(zhǎng)度應(yīng)在18至25個(gè)核苷酸之間。
引物的GC含量在40%至60%之間，引物3'末端存在C或G可以促進(jìn)結(jié)合。
引物對(duì)的熔解溫度和Tm（引物的一半退火到模板的溫度）應(yīng)相似且高于60°C。最大差值應(yīng)為5°C。
引物的3'末端應(yīng)與模板DNA完全匹配。
引物3'末端的最后5個(gè)堿基中應(yīng)至少存在2G或C堿基（GC鉗）。GC鉗促進(jìn)與靶序列的強(qiáng)結(jié)合。
可以將具有5-6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切位點(diǎn)添加到引物的5'末端。
在引物序列中應(yīng)避免二核苷酸重復(fù)（ATATATAT）或同一核苷酸重復(fù)超過(guò)4次（ACCCC）。這會(huì)導(dǎo)致誤引。
應(yīng)避免引物內(nèi)同源性或引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)避免正向和反向引物中的引物間同源性或互補(bǔ)序列。這兩種情況都可能形成自二聚體或引物二聚體。
二聚體分析的ΔG值應(yīng)在0至-9 kcal/mole之間。