G-蛋白偶聯(lián)受體GPCR是研究的相當(dāng)廣泛和深入的信號(hào)通路，也是大家深入探究的藥物靶點(diǎn)，然后再腫瘤免疫中卻沒有很好的開發(fā)，整個(gè)文章的思路也非常清晰，確認(rèn)GCRP信號(hào)通路異常-導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞信號(hào)通路的異常-腫瘤免疫。文章從單細(xì)胞數(shù)據(jù)出發(fā)，利用多個(gè)大型單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，包含19中不同的癌癥類型，確認(rèn)了Gas 偶聯(lián)的GPCR信號(hào)通路再衰竭的CD8+T細(xì)胞中富集，包含EP2、EP4、A2AR、β1AR和β2AR，他們都能促進(jìn)T細(xì)胞的功能障礙。異常的激活自然就是要探究靶向抑制該信號(hào)通路的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)利用CD8+限制性Gαs-DREADD的轉(zhuǎn)基因小鼠，抑制Gas信號(hào)，進(jìn)一步確認(rèn)了Gas-PKA信號(hào)軸促進(jìn)了CD8+T稀薄的功能障礙和免疫治療的靶點(diǎn)，文章的最后發(fā)現(xiàn)抑制Gas信號(hào)通路能夠顯著促進(jìn)免疫檢查點(diǎn)療法的免疫治療效果。
▉結(jié)果：

1.Gα偶聯(lián)的GPCR表達(dá)以及T細(xì)胞失能

基于過往研究，揭示了腫瘤細(xì)胞的onco-GPCRome和異常的GPCR信號(hào)和活性8，收集數(shù)據(jù)并對(duì)19種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)集綜合分析GPCR表達(dá)（圖1a和）。使用Seurat SCTransform scRNA-seq整合方法，分析了217,953個(gè)總的CD8+T細(xì)胞，根據(jù)地標(biāo)基因和近鄰分析ProjecTIL，將其分層為幼稚型、增殖型、細(xì)胞毒性型、效應(yīng)記憶型和衰竭型亞型（圖1b，c）。導(dǎo)致了功能性（細(xì)胞毒性和效應(yīng)記憶）和功能性（衰竭）CD8+亞型的劃分，非特異性幼稚T細(xì)胞隨機(jī)遷移通過腫瘤和增殖的T細(xì)胞，表達(dá)效應(yīng)記憶和衰竭T細(xì)胞的特征。當(dāng)分析386個(gè)非嗅覺GPCR基因的相對(duì)表達(dá)時(shí)，許多GPCR在每個(gè)CD8+T細(xì)胞亞型中顯示出不同的表達(dá)模式（圖1d）。癌癥和慢性病毒感染中終末衰竭的CD8+T細(xì)胞最常見的是表達(dá)高水平的PD-1、TIM-3、CXCR6、LAG3、CTLA-4和CXCL13蛋白，所有這些都反映在綜合分析中的轉(zhuǎn)錄組水平上，正如以前記錄和驗(yàn)證的個(gè)別數(shù)據(jù)集。在衰竭的CD8+T細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CXCR6、PTGER4、GPR65、ADGRE5和F2R是編碼GPCRs的最高度表達(dá)的基因之一，其表達(dá)模式與標(biāo)志性衰竭基因類似（圖1e）。

在黑色素瘤患者中建立了一個(gè)轉(zhuǎn)錄基因模塊，預(yù)測(cè)與LAG3表達(dá)有關(guān)的T細(xì)胞功能障礙程序（例如TIGIT、PDCD1、LAG3和CXCL13）。為了確定與該功能障礙程序最相關(guān)的GPCRs，從綜合分析中為所有CD8+T細(xì)胞生成了功能障礙評(píng)分（圖1f）。正如預(yù)期的那樣，19種癌癥類型的衰竭型CD8+T細(xì)胞顯示出最高的功能障礙得分，明顯高于增殖型、細(xì)胞毒性和效應(yīng)記憶型CD8+T細(xì)胞（圖1g）。接下來調(diào)查了與T細(xì)胞功能障礙得分最密切相關(guān)的GPCR基因。編碼CXCR6的基因，在慢性病毒感染期間表達(dá)于PD-1hi效應(yīng)和衰竭的CD8+T細(xì)胞上，是與T細(xì)胞功能障礙最顯著相關(guān)的GPCR基因19（圖1h）?？偣灿?5個(gè)GPCR基因被證明與功能障礙得分明顯相關(guān)，其中GPR56、CCRL2、GIPR和F2R是導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭的首要候選基因（圖1h）。接下來的目標(biāo)是根據(jù)異三聚體G-蛋白偶聯(lián)信息區(qū)分GPCR的表達(dá)模式，以開始定義功能基因組。根據(jù)國際基礎(chǔ)和臨床藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPHAR）的分類，根據(jù)所有GPCRs與Gα12/13、Gαi、Gαq/11或Gαs的主要G蛋白偶聯(lián)，將其歸入G蛋白程序。耐人尋味的是，當(dāng)計(jì)算每條途徑的平均相關(guān)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)Gαs程序與T細(xì)胞功能障礙的關(guān)聯(lián)度最高，而Gαi程序的關(guān)聯(lián)度最低（圖1i）。編碼Gαs偶聯(lián)GPCRs的多個(gè)基因與T細(xì)胞功能障礙呈正相關(guān)，有明顯的Spearman相關(guān)性，包括GIPR、ADORA2A、PTGER4、GPR65和TSHR（圖1j）。這些數(shù)據(jù)提出了一種GPCR-Gαs信號(hào)程序的可能性，它與腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞功能障礙相關(guān)。

2.內(nèi)源性Gas-GPCRs 削弱效應(yīng)T細(xì)胞功能

接下來調(diào)查了Gαs-GPCRs與衰竭T細(xì)胞表型的相關(guān)性。分析了小鼠淋巴細(xì)胞性絨毛膜炎病毒（LCMV）慢性感染模型的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，它代表了最近定義T細(xì)胞衰竭的里程碑式發(fā)現(xiàn)的最核心的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)（圖2a）。在這個(gè)模型中，急性感染LCMV產(chǎn)生強(qiáng)大的、增殖的和激活的效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，能夠解決感染。相比之下，慢性感染不同的LCMV菌株（克隆13）會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的抗原暴露，產(chǎn)生一種獨(dú)特的疲憊的T細(xì)胞狀態(tài)，抑制性受體持續(xù)表達(dá)，效應(yīng)性功能分層喪失。結(jié)合了三個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)集，即來自急性LCMV感染的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞和來自慢性LCMV感染的衰竭T細(xì)胞，并使用DESeq2直接比較兩種CD8+T細(xì)胞亞型之間GPCR的差異性表達(dá)。這表明，與效應(yīng)T細(xì)胞相比，編碼Gαs-GPCRs的多個(gè)基因在衰竭的T細(xì)胞中上調(diào)，包括Glp1r、Ptger2、Ptger4和Gpr65，它們也與人類腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞功能障礙明顯相關(guān)（圖1g和2b）。這表明，在慢性病毒感染期間，耗竭腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上所表達(dá)的Gαs-GPCRs在本質(zhì)上是相似的。

最近，確定了148個(gè)人類GPCRs與11個(gè)特定的人類G蛋白的耦合，并使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法來增強(qiáng)A類GPCRs的GPCR耦合預(yù)測(cè)。在這里，對(duì)其預(yù)測(cè)性的G-蛋白耦合進(jìn)行分層，如IUPHAR和報(bào)告的檢測(cè)方法所指定。發(fā)現(xiàn)IUPHAR指定的Gαs偶聯(lián)基因組與LCMV感染中耗盡的T細(xì)胞上調(diào)的GPCRs有最明顯的富集（圖2c）。其他的基因組也明顯富集于衰竭T細(xì)胞上調(diào)的GPCRs，包括GNAQ預(yù)測(cè)的偶聯(lián)、Gq/11初級(jí)IUPHAR偶聯(lián)和GNA14預(yù)測(cè)的偶聯(lián)（圖2d）。這一起表明，除了T細(xì)胞功能障礙外，這些Gαs偶聯(lián)的GPCRs的表達(dá)也可能在驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞衰竭中起作用。

為了更好地了解這些Gαs-GPCRs的表達(dá)是如何調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的，首先試圖通過在體外調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活來模擬由持續(xù)的T細(xì)胞抗原受體（TCR）信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致的T細(xì)胞功能損傷（圖2e）。來自C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞被抗CD3和抗CD28激活48小時(shí)。隨后，細(xì)胞受到額外的再刺激（慢性刺激），以模擬TCR在腫瘤處接觸后T細(xì)胞的重新激活。作為對(duì)照，CD8+T細(xì)胞也用白細(xì)胞介素-2進(jìn)行培養(yǎng)。與急性刺激的CD8+T細(xì)胞相比，PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG3在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)水平都明顯升高，同時(shí)IFNγ和腫瘤壞死因子（TNF）減少，在這種試驗(yàn)中證實(shí)慢性激活的CD8+T細(xì)胞開始獲得類似衰竭的表型。

為了模擬Gαs配體在TME的暴露，將刺激Gαs-GPCRs的配體添加到的慢性衰竭試驗(yàn)中，β1腎上腺素能受體（β1-AR）和β2AR的多巴胺以及腺苷2A受體（A2AR）的CGS-21680）。在初始激活48小時(shí)后，CD8+T細(xì)胞在有或沒有Gαs配體的情況下再進(jìn)行48小時(shí)的激活，通過流式細(xì)胞儀分析IFNγ、TNF和顆粒酶B來測(cè)量其功能能力。連續(xù)刺激和添加PGE2、多巴胺或CGS-21680都明顯減少了IFNγ、TNF和顆粒酶B的單一陽性和高細(xì)胞毒性的多功能CD8+T細(xì)胞，這是由同時(shí)表達(dá)IFNγ和TNF的細(xì)胞測(cè)量的（圖2f、g）。CD8+T細(xì)胞的活力和增殖能力也有類似的下降，如Ki-67陽性率的下降所表明。此外，PGE2和多巴胺的刺激明顯提高了PD-1和TIM-3的表達(dá)（圖2g）。T細(xì)胞功能和增殖的同時(shí)減少和抑制性受體表達(dá)的增加表明，Gαs配體增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞極化為衰竭的功能障礙表型。

為了評(píng)估Gαs配體對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷的功能抑制，激活了來自O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因小鼠的純化T細(xì)胞，其TCR對(duì)卵清蛋白（OVA）肽SIINFEKL（OVA257-264）具有特異性，并將其與表達(dá)OVA的MC38腫瘤細(xì)胞（MC38-OVA）以1：5的效應(yīng)物與靶體比例進(jìn)行共培養(yǎng)（圖2h）。Gαs配體明顯減少了OT-1 CD8+T細(xì)胞對(duì)MC38-OVA細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這是通過2天后的腫瘤細(xì)胞存活率衡量的（圖2i）?？傊?，體外實(shí)驗(yàn)確定了Gαs-GPCRs的配體對(duì)T細(xì)胞功能和細(xì)胞毒性的抑制作用。

為了闡明Gαs介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞功能障礙的基本機(jī)制，接下來描述了Gαs/cAMP下游驅(qū)動(dòng)免疫抑制的途徑，并重點(diǎn)關(guān)注PGE2，因?yàn)檫@種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致所有測(cè)試的Gαs-GPCR配體對(duì)功能的抑制最為明顯。在慢性刺激期間加入PGE2和福斯克林（fsk），一種直接的腺苷酸環(huán)化酶-cAMP激活劑，導(dǎo)致cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）明顯增加，在細(xì)胞內(nèi)cAMP和蛋白激酶A（PKA）激活增加后，CREB變得磷酸化（pCREB）（圖2j）。EP2或EP4抑制劑（分別為EP2i和EP4i）明顯減少了PGE2誘導(dǎo)的pCREB的激活，但不是fsk誘導(dǎo)的，這支持了PGE2對(duì)PKA的受體介導(dǎo)作用（圖2j）。同樣，加入EP2i或EP4i拮抗劑后，在PGE2的抑制下恢復(fù)了IFNγ和TNF的分泌，但對(duì)fsk的反應(yīng)則沒有（圖2k）。加入EP2和EP4拮抗劑比單獨(dú)加入每個(gè)拮抗劑更明顯地減少PGE2介導(dǎo)的IFNγ和TNF抑制作用，這表明同時(shí)阻斷多個(gè)Gαs受體對(duì)Gαs的激活可能提供對(duì)CD8+T細(xì)胞免疫抑制作用的更好救援。接下來，確定PGE2/cAMP誘導(dǎo)的抑制作用是否可以通過激活內(nèi)源性表達(dá)的Gαi-GPCR CXCR3與其配體CXCL10而得到拯救。盡管CXCL10單獨(dú)使用并不明顯影響IFNγ和TNF的分泌，但CXCL10與PGE2的添加可減輕PGE2的抑制作用?？傊@些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，Gαs激活導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能的抑制，這可以通過阻斷Gαs-GPCRs或刺激Gαi軸來挽救。

為了開始探索Gαs-PKA軸在PGE2介導(dǎo)的T細(xì)胞功能抑制中的作用，產(chǎn)生了條件性CD8特異性Gnas基因敲除（KO）小鼠（圖2l）。用CD8+T細(xì)胞限制性Cre重組酶與他莫昔芬2E8i-CreERT2）的小鼠與Gnas第1外顯子側(cè)翼有l(wèi)oxP位點(diǎn)的小鼠交叉（稱為CD8-Gnas KO；圖2l）。E8i-CreERT2小鼠在成熟的CD8+T細(xì)胞中表達(dá)報(bào)告基因，但在CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或自然殺傷（NK）細(xì)胞群中不表達(dá)。給予他莫昔芬后，分離出CD8+T細(xì)胞并進(jìn)行長(zhǎng)期刺激。正如預(yù)期的那樣，用PGE2處理后，具有功能性Gαs的CD8+T細(xì)胞表達(dá)較少的IFNγ和TNF（圖2m），但這種抑制在CD8-Gnas KO小鼠中得到了拯救（圖2m）。為了尋找潛在的機(jī)制，研究了PKA的參與，這是Gαs的一個(gè)關(guān)鍵下游信號(hào)效應(yīng)器。在這些研究中，利用了我們的蛋白激酶抑制劑（PKI）肽小鼠模型。Tet-GFP-PKI小鼠與E8iCreERT2-ROSA26LSLrtTA小鼠雜交，產(chǎn)生一個(gè)條件性的、四環(huán)素誘導(dǎo)的PKI系統(tǒng)，專門抑制CD8+T細(xì)胞中的PKA（稱為CD8-PKI）。在服用他莫昔芬和多西環(huán)素后，從CD8-PKI小鼠中分離出CD8+T細(xì)胞，并如上所述進(jìn)行長(zhǎng)期刺激。當(dāng)綠色熒光蛋白（GFP）-PKI在慢性激活的CD8+T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它可以防止PGE2引起的IFNγ+TNF+雙陽性CD8+T細(xì)胞的減少，這反映了Gnas的缺失（圖2m）。這強(qiáng)烈表明Gnas及其下游信號(hào)靶點(diǎn)PKA是PGE2介導(dǎo)的對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用的必要條件。