干貨系列：高通量測(cè)序后的下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法——m6A RNA甲基化篇｜易基因
大家好，這里是專(zhuān)注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
此前，我們分享了m6A RNA甲基化研究的數(shù)據(jù)挖掘思路（點(diǎn)擊查看詳情），進(jìn)而篩選出m6A修飾目標(biāo)基因。
做完MeRIP-seq測(cè)序后，如果需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。m6A RNA甲基化修飾目標(biāo)基因的進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)包括以下6個(gè)方面：
簡(jiǎn)單驗(yàn)證
全局m6A甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證m6A甲基化書(shū)否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
m6A修飾目標(biāo)基因的表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)
研究特定m6A Readers通過(guò)結(jié)合目標(biāo)基因RNA而影響目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)
（1）簡(jiǎn)單驗(yàn)證
目標(biāo)基因m6A甲基化的驗(yàn)證：MeRIP-RT-PCR
檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證m6A甲基化書(shū)否真的影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過(guò)表達(dá)、m6A甲基化抑制劑
如環(huán)亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2檢測(cè)m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點(diǎn)雜交（定性）、比色法（定量）、質(zhì)譜法（定量）
檢測(cè)目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平：RT-qPCR
檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
檢測(cè)細(xì)胞功能/表型變化
（3）靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)某區(qū)域m6A修飾是否真的影響目標(biāo)基因的表達(dá)
目的基因m6A甲基化干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase activity assay）——構(gòu)建含甲基化/未甲基化m6A位點(diǎn)的目標(biāo)基因-熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)。
檢測(cè)目標(biāo)基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
檢測(cè)細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測(cè)定... ...
（4）研究目標(biāo)基因的m6A甲基化如何影響目標(biāo)基因表達(dá)
檢測(cè)m6A是否通過(guò)影響目標(biāo)基因翻譯而影響蛋白質(zhì)水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過(guò)對(duì)結(jié)合核糖體上的mRNA進(jìn)行定量，分析目標(biāo)基因的蛋白翻譯效率
Polysome Profiling方法舉例：
研究m6A是否通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和降解而影響目標(biāo)基因蛋白水平
研究m6A對(duì)目標(biāo)基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
研究m6A是否通過(guò)調(diào)控RNA的出核（nuclear export）而影響目標(biāo)基因蛋白水平
裂解細(xì)胞，超速離心分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，然后分別進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平
writers的突變/敲降/敲除實(shí)驗(yàn)：
RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的mRNA水平變化
Western blot檢測(cè)目標(biāo)基因的蛋白水平變化
檢測(cè)目標(biāo)基因的功能writers的突變/敲降/敲除后，目標(biāo)基因的過(guò)表達(dá)回復(fù)實(shí)驗(yàn)：
檢測(cè)各項(xiàng)表型指數(shù)、細(xì)胞增殖、分化的回復(fù)情況
合理推測(cè)結(jié)合目標(biāo)基因的m6A Readers是哪一種
Readers的突變/敲降/敲除/過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)：
RT-PCR驗(yàn)證靶基因的mRNA水平
Western blot驗(yàn)證靶基因的蛋白水平
Readers的RIP-qPCR驗(yàn)證Readers蛋白與靶基因mRNA的結(jié)合
關(guān)于易基因RNA m6A甲基化測(cè)序(MeRIP-seq)技術(shù)
易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的m6A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)。
大樣本量m6A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個(gè)樣品價(jià)格高，通常難以承擔(dān)。易基因開(kāi)發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實(shí)現(xiàn)不同樣本間相對(duì)定量，降低檢測(cè)成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：
m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）
m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-MeRIP-seq）
m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq2）
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；
樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)；
重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，最大化降低抗體富集偏差；
應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運(yùn)用在分子機(jī)制的理論性研究
疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾?。ㄈ绶逝?糖尿?。?、神經(jīng)和精神疾?。ㄈ绨柶澓ＤY/抑郁癥）、炎癥…
發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個(gè)體/組織/器官生長(zhǎng)發(fā)育、干細(xì)胞分化與命運(yùn)決定、衰老
環(huán)境暴露與響應(yīng)：污染、抗逆、生活方式
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請(qǐng)致電易基因。
