細(xì)菌基因具有普遍性活性和細(xì)胞功能以及極其保守的結(jié)構(gòu)和核苷酸序列等不常見的特征。三種類型的細(xì)菌核糖體RNA（rRNA）根據(jù)其沉降率分為23s、16s 和5s三種，并且分別有大約3300、1550和120個(gè)核苷酸的測(cè)序長(zhǎng)度。16s rRNA基因已成為細(xì)菌分類學(xué)分類的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗菀缀涂焖俚販y(cè)序并且包含足夠的系統(tǒng)發(fā)育信息。

16s rRNA測(cè)序基因由八個(gè)高度保守的區(qū)域和九個(gè)可變區(qū)域組成。在整個(gè)區(qū)域中，高變區(qū)之間的保守程度差異很大，其中更保守的區(qū)域與更高級(jí)別的分類學(xué)相關(guān)，而不太保守的區(qū)域與較低級(jí)別（如屬和種）相關(guān)。

相關(guān)16s rRNA?基因序列相似性的比較通常用作物種水平分類鑒定的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，0.5%到1%的序列差異范圍通常用于描述物種分類的等級(jí)。16s?RNA測(cè)序目前是微生物分類中最常用的方法，大量的和獨(dú)特的16s?rRNA基因序列可供比對(duì)分析。

16s?rRNA測(cè)序具有以下優(yōu)點(diǎn)：

第一，16s rRNA基因分布廣泛；第二，16s rRNA基因序列豐度超過其他基因；第三，可用于測(cè)定不同類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；第四，當(dāng)擴(kuò)增和測(cè)序成本負(fù)擔(dān)得起時(shí)，水平基因轉(zhuǎn)移不是大問題；第五，成本較低。

但是16s rRNA測(cè)序也有一些缺點(diǎn)：

第一，每個(gè)基因組的拷貝數(shù)可能會(huì)有所不同，但它們往往是分類單元特異性的菌株，菌株之間的變異是可能的；第二，pcr擴(kuò)增偏差；第三，基因的多樣性傾向于過度夸大多樣性估計(jì)；第四，16s rRNA基因的分辨率通常太低而無法區(qū)分密切相關(guān)的物種；第五，測(cè)序成本下降使得微生物組學(xué)研究正在從16s測(cè)序轉(zhuǎn)為通過全基因組或宏基因組學(xué)測(cè)序達(dá)到更全面的功能表征。

完整的16s rRNA 測(cè)序工作流程，包括DNA分離、制備測(cè)序、測(cè)序數(shù)據(jù)分析使用等流程。新一代測(cè)序平臺(tái)每次讀取覆蓋100到600個(gè)堿基對(duì)，具有不同程度的準(zhǔn)確度，但16s rRNA基因全長(zhǎng)大約1500個(gè)堿基對(duì)，因此選擇針對(duì)16s rRNA基因的引物對(duì)DNA進(jìn)行選擇性pcr擴(kuò)增，覆蓋16s rRNA基因的一部分。

目前市面上有幾種引物，最常使用的是由引物27f和1492r進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行sanger DNA測(cè)序或PacBio SMART測(cè)序，因?yàn)樵诟鞣N高通量測(cè)序平臺(tái)上，不同長(zhǎng)度的DNA應(yīng)使用相應(yīng)的pcr引物 。圖中顯示了適合各種測(cè)序系統(tǒng)的引物組。

目前v1到v3區(qū)域已被確，是區(qū)分普遍存在且臨床上重要的葡萄球菌屬物種的最有用區(qū)域，該區(qū)域通常用于皮膚微生物組研究。

16srRNA的測(cè)序目前有多個(gè)分析平臺(tái)，包括Sanger sequencing、Illumina MiSeq 、454 pyrosequencing和PacBio SMART sequencing。

以Illumina MiSeq為例，通過使用有限循環(huán)pcr進(jìn)行擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)過純化、量化和合并，隨后通過使用Nextera XT索引的完整補(bǔ)充，將illumina測(cè)序適配器和雙索引條形碼添加到擴(kuò)增子目標(biāo)中，多達(dá)96個(gè)文庫可以合并在一起進(jìn)行。

高通量后的測(cè)序經(jīng)過過濾和修剪，得到高質(zhì)量序列，然后聚類成操作分類單元（OTU）。通?；谠O(shè)置的相似性閾值（通常為97%相似性）來定義OTU。聚類分析后，對(duì)OTU 進(jìn)行注釋，獲得物種的具體分類，進(jìn)而進(jìn)行OTU?系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析和其他研究。