概述

實時熒光定量PCR（Real?-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入化學(xué)熒光物質(zhì)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行定量分析的方法。根據(jù)所用化學(xué)熒光物質(zhì)的不同，qPCR可分為熒光染料法（SYBR Green Ⅰ）和熒光探針法（TaqMan）。SYBR Green Ⅰ染料可以和任何dsDNA結(jié)合，缺乏特異性，qPCR反應(yīng)中若有非特異性擴增產(chǎn)物，會增加熒光值，影響定量結(jié)果的準確性，而探針法的出現(xiàn)很好地解決了染料法非特異性的問題。

TaqMan實時熒光定量PCR基本原理

TaqMan實時熒光定量PCR依據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理，即在PCR擴增中加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告基團和一個淬滅基團；當(dāng)探針完整地結(jié)合在DNA單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號。qPCR擴增時，TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性將探針?biāo)饷盖?，使得報告基團和淬滅基團分離，從而發(fā)出熒光。切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測PCR反應(yīng)體系中的熒光強度可以達到監(jiān)測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。該方法具有特異性強、靈敏度高等特點，在目前國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。

TaqMan實時熒光定量PCR的特點

1.特異性強

在探針法qPCR中，除加入引物外還增加一條特異性探針，當(dāng)引物和探針都與靶基因結(jié)合時，擴增時探針才會被水解酶切發(fā)出熒光；當(dāng)引物發(fā)生非特異性擴增時，探針不會結(jié)合到非特異性片段上，因此不會被水解酶切而發(fā)出熒光，從而提高了特異性。

2.準確度和靈敏度高

對于低拷貝或者低濃度樣品，相比于染料法，探針法避免了引物二聚體的熒光信號干擾，提升了檢測的準確度，并且探針法可檢測低至單拷貝樣品，靈敏度高。

3.可用于多重qPCR檢測

依據(jù)探針修飾的熒光基團不同，可用于多重實時熒光PCR，即在一個反應(yīng)管中用多個熒光基團來區(qū)分不同靶基因。該方法的優(yōu)勢在于：①同時檢測多個靶基因，提高檢測效率；②如果將多重qPCR擴增的靶基因之一設(shè)為內(nèi)質(zhì)控，則可為實時熒光PCR檢測提供假陰性的內(nèi)部質(zhì)控，以判斷檢測有陰性結(jié)果的有效性。

探針設(shè)計原則

實時熒光定量PCR實驗體系的設(shè)計對于整個檢測的成功非常重要，其中探針的設(shè)計是實驗的關(guān)鍵，應(yīng)根據(jù)其特性進行設(shè)計以適應(yīng)相應(yīng)要求。

1、TaqMan探針位置盡可能靠近擴增引物，但不能與引物重疊。

2、TaqMan探針長度一般為25~32 bp之間，最好不要超過40 bp。

3、TaqMan探針的Tm值應(yīng)比引物的高5~10℃，確保引物延伸時探針完全結(jié)合在模板上；引物Tm值通常在60℃左右，探針Tm值通常在65~70℃。

4、TaqMan探針5’端第一個堿基不能是G，因為探針?biāo)饷盖泻驡堿基也能夠淬滅熒光基團所發(fā)出的熒光信號。

5、避免探針內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及探針間三個堿基以上互補，同時避免與引物有三個堿基以上互補。

6、TaqMan探針中C最好比G多，相反則選擇其互補鏈；同時避免單一核苷酸成串，尤其是GGGG。

7、目前常用的引物和探針設(shè)計有Primer Express、Primer 3、Beacon Designer 2.0和NCBI。

常見修飾基團類型

對于Taqman探針熒光修飾基團的選擇，首先要保證熒光報告基團的最大激發(fā)波長（Excitation wavelength，Ex）和最大發(fā)射波長（Emission wavelength，Em）與qPCR儀器相匹配；其次淬滅基團的吸收光譜與報告基團的發(fā)射光譜有重合。以下是常用的修飾基團類型。

迪贏生物依托先進的DNA合成技術(shù)及成熟的純化方法，推出了TaqMan探針定制服務(wù)，并嚴格執(zhí)行ISO13485質(zhì)控標(biāo)準，可確保產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。