l? CRISPR序列與Cas蛋白

CRISPR-Cas系統(tǒng)是“成簇有規(guī)律間插短回文重復(fù)序列相關(guān)系統(tǒng)”的英文首字母簡寫，它包括CRISPR序列與Cas蛋白兩部分，前者主要用于儲存外來的核酸序列，而后者是一整個蛋白家族，具多種核酸相關(guān)的活性。

CRISPR-Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古菌體內(nèi)，用于切斷并沉默外來基因，行使類似多細(xì)胞生物中獲得性免疫的功能。雖然CRISPR-Cas系統(tǒng)普遍高度保守，但在不同的生物中仍存在不同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，大致可分為ⅠⅡⅢ三類，以其Cas5蛋白作為區(qū)分依據(jù)。

要想行使其功能，CRISPR-Cas系統(tǒng)必須得到含有核酸酶指導(dǎo)序列的RNA（crRNA）從而與Cas蛋白形成復(fù)合物，指導(dǎo)具有核酸酶活性的Cas蛋白對特定基因的剪切。在Ⅰ和Ⅲ型的CRISPR-Cas系統(tǒng)中，Cas6和Cas3蛋白直接作用于crRNA的前體以形成crRNA；而在Ⅱ型的CRISPR-Cas系中，由于不具Cas6，crRNA的合成依賴于核糖核酸酶Ⅲ對前體crRNA和反式crRNA的剪切，這樣產(chǎn)生的crRNA會丟失部分堿基對。

l? 作為基因編輯工具的CRISPR-Cas9

用于基因工程的CRISPR-Cas9來自于一種Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，屬于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SF370菌株。為何選擇了Ⅱ型的CRISPR-Cas系統(tǒng)而非Ⅰ型和Ⅲ型？原因可能是Ⅱ型的CRISPR-Cas系統(tǒng)僅需Cas9一種多功能蛋白，從而使得操作更加簡便。

由于之前提到的crRNA合成產(chǎn)生的堿基丟失問題，這里的野生型CRISPR-Cas系統(tǒng)其實(shí)不適用于細(xì)致的基因編輯。因此在作為基因編輯工具的CRISPR-Cas9中，指導(dǎo)Cas9剪切的RNA并不是原來的crRNA，而是經(jīng)過人工設(shè)計(jì)的小向?qū)NA（sgRNA）。與sgRNA結(jié)合的cas9能夠特異性地識別與sgRNA上間隔序列一致目標(biāo)基因，從而達(dá)到對基因進(jìn)行精確操作的要求。

在實(shí)際運(yùn)用中，除了野生型的Cas9核酸酶（nucleases）還會用到經(jīng)過人工設(shè)計(jì)的Cas9內(nèi)切酶（nickases）。核酸酶作用的結(jié)果是雙鏈斷裂和非同源末端連接，在這個過程中會伴隨一部分堿基對的丟失，因此Cas核酸酶往往只用于沉默目標(biāo)基因或在其表達(dá)的酶活性中心引入缺刻等。而Cas9內(nèi)切酶則可在體系內(nèi)具有外源DNA的情況下導(dǎo)致高保真的同源定向修復(fù)，因而在基因編輯中更具價值。除Cas9外，較近的研究也使用Cpf1、C2c1、C2c2等酶作為更高效或適應(yīng)不同情況的切割酶與sgRNA結(jié)合。

（運(yùn)用就不寫了_(:з」∠)_）