NK（Natural killer）細(xì)胞，也稱自然殺傷細(xì)胞，因?yàn)槠浞菍Ｒ恍缘募?xì)胞毒殺作用而被命名。形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，來(lái)源于骨髓，是除T細(xì)胞、B細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，約占血液中所有免疫細(xì)胞(白細(xì)胞數(shù)量)的15%，屬于天然免疫系統(tǒng)的核心細(xì)胞，主要分布于外周血、肝臟和脾臟。

NK細(xì)胞具有部分T細(xì)胞分化抗原，如80%~90%的NK細(xì)胞呈CD2+，以及75%~90%的NK細(xì)胞呈CD38+，而且NK細(xì)胞具有IL-2中親和性受體，在IL-2刺激下可發(fā)生增殖反應(yīng)，活化的NK細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ。NK細(xì)胞是人體抵抗癌細(xì)胞和病毒感染的第一道防線，可非特異性識(shí)別并消除腫瘤細(xì)胞，這種天然殺傷活性無(wú)MHC限制，也不需要抗體參與。除了具有強(qiáng)大的殺傷功能外，NK細(xì)胞還具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，與機(jī)體其他多種免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)和免疫功能。

一、細(xì)胞背景介紹

01

NK-92細(xì)胞是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來(lái)的一株白細(xì)胞介素-2（IL-2）依賴型的NK細(xì)胞株。這株細(xì)胞對(duì)很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性；鉻釋放試驗(yàn)顯示它能殺死K562和DAUDI細(xì)胞。NK-92細(xì)胞(經(jīng)過(guò)照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的體外免疫清掃而不危及血細(xì)胞的功能。

NK-92細(xì)胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標(biāo)記陽(yáng)性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標(biāo)記陰性。

02

NK-92/MI細(xì)胞，是通過(guò)微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA對(duì)NK-92進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株。

二、細(xì)胞特性及培養(yǎng)注意事項(xiàng)

01細(xì)胞特點(diǎn)

細(xì)胞偏圓或偏橢圓，透亮，成團(tuán)生長(zhǎng)。只有成團(tuán)的細(xì)胞有增殖活性，單個(gè)的細(xì)胞基本沒(méi)有增殖活力。細(xì)胞團(tuán)可生長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的大團(tuán)塊，死了的細(xì)胞會(huì)皺縮，不再透亮而變得灰暗。細(xì)胞對(duì)氧氣、養(yǎng)分及細(xì)胞密度非常敏感，養(yǎng)分不夠或密度太高情況下，細(xì)胞很容易凋亡。

02細(xì)胞培養(yǎng)技巧

1、細(xì)胞剛復(fù)蘇或密度較低時(shí)：可以把培養(yǎng)瓶立起來(lái)培養(yǎng)，以提高細(xì)胞密度，促進(jìn)細(xì)胞聚團(tuán)。當(dāng)細(xì)胞聚團(tuán)正常生長(zhǎng)后，建議平躺著培養(yǎng)該細(xì)胞，以增大空氣交換面積，且液體高度最好不要超過(guò)3mm，一般T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基，T75培養(yǎng)瓶加15ml左右培養(yǎng)基即可。
2、換液：2-3天換液一次。

• 半換液法：換液時(shí)輕輕側(cè)過(guò)培養(yǎng)瓶/皿，避免晃動(dòng)細(xì)胞，用巴氏吸管輕輕吸取部分上清棄去，補(bǔ)加等體積的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

• 離心法：將全部培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，吸去上清后用新鮮培養(yǎng)輕輕重懸后重新種瓶，重懸時(shí)不可吹打過(guò)度。

3、傳代：細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)，且T25瓶子有幾十上百個(gè)小團(tuán)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)比較多，此時(shí)應(yīng)該2天換液一次。當(dāng)一個(gè)20倍視野有4-5個(gè)大細(xì)胞團(tuán)時(shí)應(yīng)該進(jìn)行傳代。傳代時(shí)加入兩倍體積的新鮮培養(yǎng)基后，輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，將大的細(xì)胞團(tuán)打散成小團(tuán)，但不要?jiǎng)×掖荡虺蓡渭?xì)胞懸液，因?yàn)閱蝹€(gè)的細(xì)胞是基本沒(méi)有增殖活力的細(xì)胞，然后將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中?；蛘邔⒓?xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min后，棄去上清，加入三倍體積的新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸后轉(zhuǎn)移至三個(gè)新的培養(yǎng)瓶中。

4、吹打操作注意事項(xiàng)：細(xì)胞團(tuán)塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數(shù)以及力度，即使細(xì)胞都分散成單個(gè)，也會(huì)在1~2天內(nèi)聚集起來(lái)；建議只在細(xì)胞產(chǎn)生大量碎片時(shí)才離心清洗。

5、復(fù)蘇：復(fù)蘇時(shí)可適當(dāng)加大胎牛血清的含量，以使細(xì)胞盡快長(zhǎng)起來(lái)。復(fù)蘇后細(xì)胞需要重新聚團(tuán)，故復(fù)蘇時(shí)間較長(zhǎng)，期間應(yīng)多加觀察，并注意更換培養(yǎng)基，頻率為3天一換（半換液法）。

三、NK-92和NK-92MI的區(qū)別

1. NK-92生長(zhǎng)依賴于IL-2，而NK-92MI不依賴；

2. NK-92生長(zhǎng)速度較慢于NK-92MI；

3. 凍存液配方：凍存時(shí)細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在0.5-1.0×106（10的六次方）/ml；

   NK-92：50%胎牛血清+40%完全培養(yǎng)基+10%DMSO；

   NK-92MI：90%胎牛血清+10%DMSO。

四、IL-2使用注意事項(xiàng)

1、NK-92細(xì)胞對(duì)IL-2敏感，建議使用高質(zhì)量IL-2。2、NK-92MI正常培養(yǎng)時(shí)不需要添加IL-2；當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)較差時(shí)，可按200U/ml的濃度添加IL-2，培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞狀態(tài)改善即可正常培養(yǎng)。

3、IL-2保存于-20℃，4℃保存不超過(guò)兩周。

4、含有IL-2的完全培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配或保存于4℃冰箱中兩周內(nèi)用完，使用前恢復(fù)至室溫即可，切勿加熱。