前言

癌癥是全世界最致命的疾病之一。近年來，免疫療法被認(rèn)為是一種非常有前景的癌癥治療策略，重點(diǎn)是重新激活癌細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制環(huán)境，提高抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，免疫療法仍然面臨許多挑戰(zhàn)。即使是最流行的抗 PD-1/PD-L1 和抗 CTLA4 療法，也只有一小部分人表現(xiàn)出持久反應(yīng)，這表明需要對癌癥免疫進(jìn)行更深入的研究。

2020年05月，國家肝癌中心、第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)在 Advanced Science期刊發(fā)表的題為 “Trajectory and Functional Analysis of PD-1 CD4CD8 T Cells in Hepatocellular Carcinoma by Single-Cell Cytometry and Transcriptome Sequencing”的研究成果，采用質(zhì)譜流式細(xì)胞儀、單細(xì)胞測序等研究方法，發(fā)現(xiàn)CD4/CD8 雙陽性 T (DPT) 細(xì)胞的存在，并表征了 DPT 細(xì)胞的分子特征，DPT細(xì)胞在 HCC中的獨(dú)特分布和臨床預(yù)后的相關(guān)性，為腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞的功能和起源提出了新的見解。

研究背景

腫瘤免疫微環(huán)境的空間異質(zhì)性是腫瘤免疫治療的主要挑戰(zhàn)，HCC微環(huán)境顯示出比非腫瘤組織更復(fù)雜和免疫抑制的表型，可誘導(dǎo)腫瘤逃逸并促進(jìn)疾病進(jìn)展。本研究通過使用單細(xì)胞規(guī)模的飛行時(shí)間質(zhì)譜（CyTOF），發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞組成空間變化。通過對 T 細(xì)胞群的深入分析，作者確定了一小部分共表達(dá)CD4/CD8 雙陽性 T 細(xì)胞 (DPT)。單細(xì)胞 RNA-seq和 TCR-seq 進(jìn)一步表征了 DPT 細(xì)胞的分子特征和克隆型。結(jié)果表明，腫瘤相關(guān)的 DPT 細(xì)胞可能來源于浸潤的 CD4 或 CD8 單陽性 T (SPT) 細(xì)胞。

研究思路

研究結(jié)果

1.肝細(xì)胞癌主要免疫譜系的空間異質(zhì)性

作者首先對來自腫瘤核心（T）、非腫瘤區(qū)域（N）和前沿區(qū)域（L）的 39 個(gè)匹配組織標(biāo)本進(jìn)行了大規(guī)模的大規(guī)模細(xì)胞免疫分析（圖1A），免疫譜系的分布在 tSNE 圖中可視化（圖 1B）。觀察到HCC中T細(xì)胞的數(shù)量從N區(qū)逐漸減少到T區(qū)，而B細(xì)胞的趨勢相反；觀察到幾個(gè) T 細(xì)胞亞簇在 L 區(qū)域顯著富集（圖 1B），在來自不同區(qū)域的不同免疫細(xì)胞譜系中觀察到表面標(biāo)志物的多樣化表達(dá)模式（圖 1C，D）。這些結(jié)果表明，HCC中的免疫微環(huán)境在空間上是異質(zhì)的。

圖1 | 肝細(xì)胞癌主要免疫細(xì)胞譜系的空間異質(zhì)性

整個(gè)工作流程的圖形摘要。提取手術(shù)切除的樣本中的免疫細(xì)胞并用金屬標(biāo)記的抗體進(jìn)行處理，然后進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)譜流式細(xì)胞儀管道。獲得的數(shù)據(jù)在降維后可視化。通過手動(dòng)門控策略和聚類算法識別細(xì)胞簇。T指腫瘤核心區(qū)；L 指前沿區(qū)域；N指非腫瘤區(qū)域。

2.T細(xì)胞簇呈現(xiàn)區(qū)域多樣性并在L區(qū)域顯示出獨(dú)特的特征

為了探索三個(gè)區(qū)域中不同的 T 細(xì)胞亞群組成，作者可視化并重新分析了 T 細(xì)胞亞群。通過應(yīng)用 FlowSOM 算法，可以將 T 細(xì)胞劃分為 40 個(gè)簇（包括來自三個(gè)區(qū)域的所有 T 細(xì)胞）（圖 2A ）。然后，作者首先將 40 個(gè)集群分類為經(jīng)典的 T 亞型。發(fā)現(xiàn) CD4 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (Tem) 從 N 到 L到 T區(qū)域逐漸增加，而 CD8 Tem 則呈現(xiàn)相反的趨勢 （圖 2B）。圖表根據(jù)面標(biāo)記的代表性表達(dá)模式（圖 2D，E），發(fā)現(xiàn)幾個(gè)富含T的T細(xì)胞簇（8, 7, 3, 2, 1）表現(xiàn)出衰竭狀態(tài)，PD-1水平高，HLA-DR表達(dá)低，許多富含 N 的簇 (39, 33, 32) 表現(xiàn)出 PD-1/HLA-DR 低表達(dá)和 CD45RA 表達(dá)增加的靜止?fàn)顟B(tài)。

作者注意到，在 13 名 HCC 患者中，至少有 8 名（>61%）的 L 區(qū)富含 DPT 細(xì)胞。此外，作者還觀察到 DPT 簇與簇 21、16、26、12、15 和 11 之間的強(qiáng)表型相關(guān)性，它們都是 CD28 T 細(xì)胞。

圖2 | T細(xì)胞簇的構(gòu)成表現(xiàn)出區(qū)域多樣性，L區(qū)在T細(xì)胞方面表現(xiàn)出獨(dú)特的免疫背景

3.腫瘤相關(guān)DPT細(xì)胞的表型和功能

為在 T 細(xì)胞成熟過程中，經(jīng)典的 DPT 細(xì)胞是胸腺中定義明確的幼稚 T 細(xì)胞。然而，對腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞的分子特征和功能的研究很少。為了進(jìn)一步探索 DPT 細(xì)胞的潛在貢獻(xiàn)，作者根據(jù) CD4 和 CD8 的表達(dá)模式將 T 細(xì)胞分離為 CD4 單陽性 (CD4 SPT)、CD8 單陽性 (CD8 SPT)、雙陰性 (DNT) 和雙陽性 (DPT) 細(xì)胞 (圖 3A )。如圖 3B所示，在高達(dá) 70% 的 HCC 患者 (9/13) 中發(fā)現(xiàn) L 區(qū) DPT 細(xì)胞顯著增加。作者進(jìn)一步探討了 DPT 細(xì)胞中 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物和 T 細(xì)胞耗竭標(biāo)志物之間的共表達(dá)模式。在 PD-1、CXCR3、CCR4 和 CD28 之間觀察到強(qiáng)陽性共表達(dá)（圖 3D）。此外，發(fā)現(xiàn)記憶T細(xì)胞的標(biāo)志物CD45RO與PD-1呈陽性共表達(dá)。流式細(xì)胞儀手動(dòng)門控圖進(jìn)一步證實(shí)了這種共表達(dá)。

觀察到包括CD28、CD69、CD44和ICOS在內(nèi)的T細(xì)胞活化相關(guān)標(biāo)志物在PD-1 ?CD45RO DPT細(xì)胞中上調(diào)，表明PD-1 CD45RO DPT細(xì)胞可能表現(xiàn)出活化表型。這種在 SPT 細(xì)胞中表達(dá)和激活的 PD-1 表型已在肺癌中報(bào)道。?

然后，通過比較 SPT、DPT 和 DNT 細(xì)胞之間免疫耗竭因子的表達(dá)水平。幾乎所有免疫衰竭標(biāo)志物在 PD-1CD45RO DPT 細(xì)胞中均顯著上調(diào)（圖 3E、F）。通過體外實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)在 PMA 和離子霉素刺激后，DPT 細(xì)胞（從 L 區(qū)分離）表達(dá)更高水平的 IFN γ、 TNF α ，這證實(shí)了 DPT 細(xì)胞可能處于激活階段（圖 3G）。DPT 表達(dá)的 IL-2 水平與 CD8SPT 細(xì)胞相似，這表明它們具有激活其他 T 細(xì)胞的能力。

圖3 | DPT細(xì)胞的表型和功能

4. DPT 細(xì)胞存在于各種具有相似表型的人類癌癥中，是 HCC 的重要預(yù)后因素

為了進(jìn)一步確認(rèn) PD-1DPT 細(xì)胞在體內(nèi)的空間分布，作者同時(shí)用 CD4/CD8/PD-1 抗體標(biāo)記 HCC 組織，并檢查 T 細(xì)胞在 T、L 和 N 區(qū)域的散發(fā)性浸潤（圖 4A）。與之前的結(jié)果一致（圖 2C），CD8SPT 細(xì)胞主要位于 N 區(qū)，CD4 + SPT 細(xì)胞主要位于 T 區(qū)。PD-1DPT 細(xì)胞在 T/N 區(qū)幾乎看不到，在 L 區(qū)廣泛存在，所有三種抗體的染色信號都很強(qiáng)。通過HALO軟件計(jì)數(shù)PD-1DPT（三陽性）細(xì)胞數(shù)。作者發(fā)現(xiàn) PD-1DPT 細(xì)胞在不同 HCC 患者的 L 區(qū)是可變的（圖 4B），并且與 DPT 細(xì)胞的數(shù)量高度相關(guān)（圖 4C）。

生存分析表明，更多的 DPT 細(xì)胞和 PD-1DPT 細(xì)胞顯著表明更好的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率（圖 4D）。但是，對于 T 或 N 區(qū)域，無法觀察到該結(jié)果，提示DPT細(xì)胞可能在L區(qū)特異性發(fā)揮其功能。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 DPT 細(xì)胞的存在和功能，分析了另外 30 例獨(dú)立 HCC 病例和 10 例肝內(nèi)膽管癌 (ICC) 病例以及之前報(bào)道的 70 例腎透明細(xì)胞癌 (RCC) 病例的 T 細(xì)胞譜。如以上部分所述，與 SPT 細(xì)胞相比，在所有三個(gè)數(shù)據(jù)集中都發(fā)現(xiàn)了具有更高免疫檢查點(diǎn)標(biāo)記表達(dá)的 DPT 細(xì)胞（圖 4E）。為了擴(kuò)展作者的發(fā)現(xiàn)，作者用 Hepa 1-6 細(xì)胞系驗(yàn)證了兩種 HCC 小鼠模型（原位/皮下）中 DPT 細(xì)胞的存在（圖 4F，G）。此外，PD-1 表達(dá)在鼠 DPT 中明顯上調(diào)。總之，這些結(jié)果表明DPT細(xì)胞不僅存在于HCC中，還存在于其他腫瘤中。

圖4 | DPT 細(xì)胞存在于具有相似表型的各種人類癌癥中，并在 HCC 中顯示出預(yù)后價(jià)值

5.B 單細(xì)胞 RNA-Seq 和 TCR-Seq 對腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞的表征

CyTOF 抗體 panel 的檢測范圍受限于可用金屬同位素的數(shù)量，為了進(jìn)一步探索 DPT 細(xì)胞的功能和進(jìn)化軌跡，作者對 5018 個(gè)腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞 (TDPT)、3676 個(gè) CD4 單陽性 T 細(xì)胞 (TCD4T)、4470 個(gè) CD8 單細(xì)胞進(jìn)行了分類和執(zhí)行單細(xì)胞 RNA-seq 和 TCR-seq陽性 T 細(xì)胞 (TCD8T) 和 4652 個(gè) PBMC CD3T 細(xì)胞 （圖 5A ），scRNA-seq 分析確定了 11 個(gè) DPT 細(xì)胞亞群（圖 5B，C）。

為了檢查不同 DPT 簇的表型，作者分別根據(jù)與 FGFBP2、IFNG 和 HAVCR2 表達(dá)相關(guān)的前 20 個(gè)基因，通過細(xì)胞毒性、激活和耗竭特征對細(xì)胞進(jìn)行評分。TDPT_3_CTLA4 和 TDPT_6_FOXP3 都具有高耗竭特征，伴隨著低細(xì)胞毒性和激活特征（圖 5D）。然后，作者檢查了所有 DPT 簇中的細(xì)胞毒性和耗竭特征之間的聯(lián)系，并觀察到大多數(shù) DPT 簇表現(xiàn)出高細(xì)胞毒性特征或耗竭特征（圖 5E）?？偟膩碚f，TDPT_10_LAG3 在表型上與之前 CyTOF 分析定義的 PD-1DPT 細(xì)胞一致。

通過分析 DPT 集群中的 TCR 克隆型，作者發(fā)現(xiàn) TDPT_2_CCR7、TDPT_3_CTLA4 和 TDPT_6_FOXP3 具有最多的不同 TCR 克隆型，且擴(kuò)展趨勢最小（圖5F）。相反，TDPT_1_FGFBP2、TDPT_5_KLRG1、TDPT_8_CD70 和 TDPT_11_KLRD1 具有最少的 TCR 克隆型，但具有最高的擴(kuò)展趨勢，觀察到DPT細(xì)胞的細(xì)胞毒性和活化與TCR擴(kuò)增呈正相關(guān)，而未分化和耗竭呈負(fù)相關(guān)(圖 5F）。

圖5 |?通過單細(xì)胞 RNA-seq 和 TCR-seq 表征腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞

6.源自浸潤性 SPT 細(xì)胞的腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞

雖然血液和外周淋巴組織中的 DPT 細(xì)胞已被廣泛研究，但它們在癌癥中的分子特征和細(xì)胞功能尚不清楚。CD45RO 和 PD-1 的共表達(dá)在 DPT 細(xì)胞中最高，其他免疫衰竭標(biāo)志物（TIM3 和 CTLA-4）在 DPT 細(xì)胞中的表達(dá)也略有增加。

對單個(gè)陽性 T (SPT) 細(xì)胞進(jìn)行了 scRNA-seq 分析，包括 3676 個(gè)腫瘤相關(guān) CD4T 細(xì)胞和 4470 個(gè) CD8 + T 細(xì)胞。CD4T 細(xì)胞和 CD8T 細(xì)胞分別分為五個(gè)和六個(gè)簇（圖 6A、B）。作者分析了 DPT 細(xì)胞簇和 SPT 細(xì)胞簇之間的轉(zhuǎn)錄組相似性（特征基因表達(dá)的 Pearson 相關(guān)性）（圖 6C)。

TCR 分析顯示，與 PBMC 相比，TDPT 細(xì)胞與 TCD4 和 TCD8 共享更多的 TCR 克隆，表明腫瘤相關(guān) DPT 細(xì)胞最有可能從腫瘤內(nèi) SPT 細(xì)胞轉(zhuǎn)化（圖 6D）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) DPT 細(xì)胞主要與 CD8T 細(xì)胞共享高頻 TCR 克?。▓D 6E）。在 DPT/SPT 的 UMAP 上預(yù)測了頻率最高的前六個(gè) TCR 克?。▓D 6F）。

通過應(yīng)用多重免疫熒光組織染色，作者還觀察到 PD-1CD8SPT 細(xì)胞在空間上比 PD-1 + CD4 + SPT 細(xì)胞更接近 PD-1 + DPT 細(xì)胞，而在 PD-1 中沒有發(fā)現(xiàn)這種差異- DPT 細(xì)胞（圖 6G，H）?？傊?，作者的數(shù)據(jù)描繪了 T 細(xì)胞的表型發(fā)育路徑，并表明 PD-1DPT 細(xì)胞來源于腫瘤內(nèi) CD8 T 細(xì)胞，而不是胸腺中的 PD-1 CD4或幼稚 T 細(xì)胞。

圖6 |?腫瘤相關(guān)的 DPT 細(xì)胞來源于浸潤的 SPT 細(xì)胞

相關(guān)討論

免疫微環(huán)境在不同癌癥之間表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，在不同個(gè)體之間表現(xiàn)出高度多樣性。對人類腫瘤中不同免疫成分的密度、位置和功能的探索導(dǎo)致了關(guān)鍵原癌和抗腫瘤免疫特征的鑒定。各種腫瘤的組織病理學(xué)分析證實(shí)，浸潤的免疫細(xì)胞在腫瘤及其周圍非腫瘤區(qū)域內(nèi)的分布存在很大差異。腫瘤細(xì)胞和相鄰基質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_已被確定為腫瘤進(jìn)展的重要驅(qū)動(dòng)因素?；|(zhì)誘導(dǎo)的炎癥和血管生成已被證明具有促進(jìn)腫瘤的作用。

然而，前沿區(qū)域（從腫瘤核心到相鄰非腫瘤組織的過渡區(qū)域）的特征性免疫微環(huán)境尚未得到很好的研究。作者獲得了 17 432 600 個(gè)免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志物譜，并發(fā)現(xiàn)了不同的 L 區(qū)特異性免疫細(xì)胞特征。在 T 細(xì)胞方面，CD4 和 CD8 雙陽性 T (DPT) 細(xì)胞表達(dá)衰竭和激活標(biāo)志物，在一些患者的 L 區(qū)顯著富集。

以前，雙陽性 T 細(xì)胞被描述為胸腺內(nèi)的過早發(fā)育階段。一般認(rèn)為，一旦分化，CD4譜系和 CD8譜系是針對單個(gè)細(xì)胞確定的。盡管已經(jīng)報(bào)道了在某些疾病條件下成熟的 DPT 細(xì)胞，但對其起源和潛在的生物學(xué)功能知之甚少。

在作者的研究中，作者首先報(bào)道了大多數(shù)富含 L 的 DPT 簇具有表型活性和記憶樣，具有增強(qiáng)的 PD-1/CD45RO 表達(dá)。在體外研究中，DPT細(xì)胞在刺激后表現(xiàn)出與SPT細(xì)胞一樣的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，證實(shí)了它們的抗腫瘤活性狀態(tài)。作者發(fā)現(xiàn) L 區(qū)富集的 DPT 細(xì)胞與 HCC 患者的更好結(jié)果呈正相關(guān)。總的來說，作者這里的數(shù)據(jù)暗示 DPT 細(xì)胞對 HCC 患者的潛在抗腫瘤活性。

為了進(jìn)一步研究富含 L 的 DPT 細(xì)胞的多樣性，單細(xì)胞測序并發(fā)現(xiàn)了 11 個(gè) DPT 簇?；讵?dú)特的基因特征，表型與 CyTOF 定義的 PD-1DPT 細(xì)胞具有高度相似性，這證明了作者的假設(shè)，即 PD-1DPT 細(xì)胞是功能性活化細(xì)胞。

為了確定富含 L 的 DPT 細(xì)胞在 T 細(xì)胞發(fā)育軌跡中的位置， TCR-seq 數(shù)據(jù)表明 PD-1DPT 細(xì)胞與 PD-1CD8T 細(xì)胞共享大多數(shù) TCR 克隆型，表明具有相同的祖先，并且起源于腫瘤內(nèi) CD8SPT 細(xì)胞，這與之前的研究一致，即 CD8T 細(xì)胞在某些條件下可以轉(zhuǎn)化為成熟的功能性 DPT 細(xì)胞。?

小鹿推薦

通過特定區(qū)域取樣，結(jié)合 CyTOF 和單細(xì)胞測序技術(shù)，作者在 HCC 的 L 區(qū)定義了一個(gè)獨(dú)特的富含 DPT 的免疫微環(huán)境。通過生信技術(shù)分析，作者鑒定出具有不同功能的多樣化 DPT 簇。PD-1DPT 細(xì)胞表現(xiàn)出激活狀態(tài)，強(qiáng)烈表達(dá)衰竭和激活標(biāo)志物，結(jié)合臨床分析，提示其在 HCC 患者中具有潛在的預(yù)后價(jià)值。

此外在探索細(xì)胞起源上，作者通過單細(xì)胞測序和TCR測序技術(shù)手段，確定了PD-1DPT 細(xì)胞的起源與 PD-1CD8SPT 細(xì)胞具有相同的祖先，并且很可能是從瘤內(nèi) SPT 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的，值得借鑒學(xué)習(xí)。

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