光片顯微鏡的原理

光片顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是結(jié)合了兩條相互正交的不同光路，一條用于快速寬視場的檢測，另一條通過一片薄光片用于照明。一般來說，光片處于檢測路徑的焦平面上，光片的束腰處于視野的中心（圖1-1）。

圖1-1

?照明與檢測物鏡相互正交，樣品置于兩個(gè)物鏡焦平面的相交處，樣品的其中一小片會被一片薄薄的激光光片所照亮。從圖中的上方往下看，光片束腰應(yīng)在視野的中心位置且與檢測路徑的焦平面完全重合。

光片照明

選擇平面照明顯微鏡（Selective Plane Illumination Microscopy, SPIM）的特殊結(jié)構(gòu)解決了單鏡頭結(jié)構(gòu)的兩條基本限制： (1) 在低數(shù)值孔徑（NA）的物鏡中獲得很薄的光學(xué)切面是非常困難的； (2) 在對樣品的單個(gè)區(qū)域進(jìn)行成像時(shí)整個(gè)樣品都處于被激光照亮的狀態(tài)，這會增加數(shù)倍熒光漂白和光毒性的可能：在獲取樣品的N個(gè)平面信息的同時(shí)，

個(gè)平面都在激光下曝光了N次

（圖1-2A）。 相比之下，在SPIM中，只有檢測物鏡的焦平面被選擇性地照亮（圖1-2B），這能有效使得樣品接收的激光能量輸入減少。在獲取N個(gè)平面的信息時(shí)

每個(gè)平面也只會曝光一次

。光片的厚度決定了軸向光學(xué)切面（XY面）的厚度，然而SPIM的光片厚度比普通顯微鏡技術(shù)中檢測物鏡的景深要薄得多。因此，通過光片顯微鏡，我們可以在大樣本中獲得大視場且薄的 光學(xué)切片。

圖1-2

?

與共聚焦激光掃描顯微鏡相比，光片顯微鏡有許多顯著優(yōu)勢。（A）在使用共聚焦顯微鏡時(shí)，即使只成像單個(gè)平面，整個(gè)樣品也會被均勻得被激光照亮；（B）在使用光片顯微鏡時(shí)只有檢測的目標(biāo)平面才會被選擇性地照亮；（C）在使用共聚焦顯微鏡時(shí)，激光檢測點(diǎn)需要掃遍整個(gè)樣本后獲得一張圖像；（D）在使用光片顯微鏡時(shí)，整個(gè)視野范圍同時(shí)檢測從而可以在短時(shí)間內(nèi)獲得一張圖像；（E）在光片顯微鏡的橫向分辨率與寬場熒光顯微鏡相同時(shí)，因?yàn)楣馄彰骷夹g(shù)，光片顯微鏡的軸向分辨率會顯著提升（在10×/0.3的鏡頭下，分別可以達(dá)到共聚焦顯微鏡與寬場熒光顯微鏡的2倍與2.5倍）。

寬視野檢測

由于其獨(dú)特的光學(xué)構(gòu)造，光片顯微鏡還提供了另一個(gè)優(yōu)勢。在使用共聚焦顯微鏡時(shí)，需要通過小孔進(jìn)行信號識別，因此需要進(jìn)行非常耗時(shí)的逐點(diǎn)掃描（圖1-2C）；而在使用光片顯微鏡 時(shí) ，可以在一次曝光中用一個(gè)穿過整個(gè)樣本的光學(xué)切片獲得整個(gè)平面的圖像（圖1-2D），在整個(gè)曝光期間內(nèi)（通常是幾毫秒）每個(gè)像素點(diǎn)都在收集光子。相比之下，在使用共聚焦顯微鏡成像時(shí)，掃描設(shè)備需要從一個(gè)像素點(diǎn)快速移動到下一個(gè)，在這之間只能停留幾微秒。因此在光片顯微鏡成像時(shí)，所有像素平行記錄的效率非常高，這可以使得在成像時(shí)樣本的局部激發(fā)強(qiáng)度可以保持很低的水平。此外，如果配合更快且靈敏度更高的相機(jī)，光片顯微鏡獲取非常大的圖像數(shù)據(jù)組的能力會比其他任何技術(shù)都快得多，同時(shí)仍然保證了極高的信噪比和最小的光毒性。這使得光片顯微鏡成為在對敏感活體組織造成最少侵入的同時(shí)對其進(jìn)行快速動態(tài)發(fā)育過程追蹤的最理想的技術(shù)。

大樣本

光片照明在對大樣本進(jìn)行成像時(shí)用低NA、低放大率和長工作距離物鏡的顯微鏡尤其有利。在光片顯微鏡的橫向分辨率與寬場熒光顯微鏡相同時(shí)，軸向分辨率主要由光片厚度決定。例如，如果同時(shí)使用10×/0.3的鏡頭，光片顯微鏡的 軸向分辨率可以達(dá)到共聚焦顯微鏡的兩倍。

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