在現(xiàn)代生物科技領(lǐng)域，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)成為最受歡迎的基因編輯工具之一。這種技術(shù)可以用來研究基因功能，疾病診斷和治療等方面。其中最常用的應(yīng)用就是構(gòu)建基因敲除細胞模型。

本文將介紹CRISPR技術(shù)的基本原理和操作流程，以幫助您更好地了解和使用這種重要的基因編輯工具。

一、CRISPR技術(shù)的基礎(chǔ)原理

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術(shù)最初是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然的細菌防御系統(tǒng)，后來被發(fā)現(xiàn)可以被用于基因編輯。

CRISPR-Cas9技術(shù)基于一種叫做“RNA導向”的機制（guide RNA, gRNA），這種機制可以讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)選擇性地識別和切割DNA中的特定序列。

這意味著我們可以使用CRISPR-Cas9來精確地編輯細胞中的基因序列，包括基因敲除、插入、替換等等。

二、操作流程

CRISPR-Cas9技術(shù)的操作流程分為四個主要步驟：設(shè)計gRNA、構(gòu)建質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染細胞、鑒定細胞。

1.設(shè)計gRNA：gRNA是由CRISPR-Cas9系統(tǒng)識別并切割目標DNA的關(guān)鍵部分。我們需要在目標基因中選擇一個合適的靶點序列，設(shè)計gRNA來引導Cas9蛋白識別并切割該序列。

耐思開發(fā)的Quick-KO?基因敲除試劑盒根據(jù)已知的人和小鼠編碼基因，采用優(yōu)化的預(yù)設(shè)計方案，相較于傳統(tǒng)方案具有更高的敲除效率。

2.構(gòu)建質(zhì)粒：質(zhì)粒是攜帶CRISPR-Cas9系統(tǒng)和gRNA的載體。在構(gòu)建質(zhì)粒時，我們需要將Cas9基因和gRNA序列克隆到質(zhì)粒中，并確保它們可以在細胞中穩(wěn)定表達。

耐思Quick-KO?基因敲除試劑盒中的Cas9質(zhì)粒和gRNA質(zhì)粒分別攜帶Blasticidin和Puromycin/mCherry篩選標記，方便用戶進行陽性細胞富集。

3.轉(zhuǎn)染細胞：將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到目標細胞中，讓它們表達CRISPR-Cas9系統(tǒng)并編輯目標基因。轉(zhuǎn)染可以通過電穿孔或者化學轉(zhuǎn)染的方法進行。

此外，針對轉(zhuǎn)染效率低的細胞，也可以選擇慢病毒款的耐思Quick-KO?基因敲除試劑盒。

4.鑒定細胞：最后一步是對成功轉(zhuǎn)染的細胞進行篩選，通過PCR和測序的方法，篩選出具有目標基因敲除的細胞。

三、目標細胞類型

CRISPR技術(shù)可以用于多種細胞類型的編輯，包括哺乳動物細胞、酵母菌、昆蟲細胞和植物細胞等。

其中，人類細胞是最常用的細胞模型之一，可以用于疾病模型的構(gòu)建、藥物篩選和基礎(chǔ)研究等方面。

耐思Quick-KO?基因敲除試劑盒主要針對人類細胞、小鼠細胞等哺乳動物細胞開發(fā)。

對于不同的目標細胞類型，我們需要根據(jù)細胞的特點和CRISPR技術(shù)的限制來選擇合適的CRISPR-Cas9系統(tǒng)和轉(zhuǎn)染方法。