結腸壁由四層組成：最內的粘膜層（上皮層）、粘膜下層、固有肌層和最外的漿膜層。哺乳動物的腸道上皮是單層柱狀上皮結構，包含吸收型細胞和分泌型細胞，分別具有吸收營養(yǎng)和分泌激素、黏液等作用，但由于各種損傷壓力的存在，腸道中的細胞會持續(xù)死亡，而新腸上皮細胞的產(chǎn)生是由腸道干細胞不斷增殖分化實現(xiàn)的。在腸道中，腸絨毛之間存在一些內陷，稱為隱窩。腸道干細胞則位于隱窩基底位置，在那里，腸道干細胞被含有各類信號因子的環(huán)境所包圍，同時與腸上皮頂端接觸到的菌群代謝物和食物營養(yǎng)素組成的外環(huán)境，共同塑造了腸干細胞的上皮側微環(huán)境。與此同時，在腸上皮下層存在的眾多微環(huán)境細胞（包括基質細胞及免疫細胞等）共同構筑了基底側微環(huán)境。該微環(huán)境的細胞群產(chǎn)生信號通路相關配體和可溶性細胞因子、趨化因子和生長因子，調節(jié)干細胞的行為。

2023年5月，來自德國BIMSB的Michael Sigal團隊等人在Nature Communications上發(fā)表題為“Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche”的文章。

本文中，作者通過上皮細胞與其基質細胞共培養(yǎng)來實現(xiàn)體外隱窩形成，同時維持增殖干細胞以及分化細胞。使用這種共培養(yǎng)的方式，成功構建出了結腸類器官組裝體，證實了上皮細胞和基質細胞之間的相互作用能促進隱窩的形成。

為了研究上皮和基質之間的相互作用，作者首先致力于研究模型的構建。前期的研究發(fā)現(xiàn)簡單地將原代基質細胞和上皮細胞共培養(yǎng)，并不能實現(xiàn)完美的體外模型，因為基質細胞傾向于從基質膠中遷移出來并粘附在板底。為了解決這個難題，作者先構建結腸類器官和正常培養(yǎng)基質細胞，再將預培養(yǎng)的基質細胞混合到基質膠液滴后立刻加入單個類器官。為了防止基質細胞的遷移，作者將培養(yǎng)物置于軌道振蕩器生長。使用活細胞熒光成像，能夠跟蹤上皮和基質細胞于不同時空階段的生長狀態(tài)，在組合培養(yǎng)的第4天，類器官組裝體便形成由緊密連接的基質層包圍的隱窩狀結構。同時由于基質細胞為體內的腸隱窩提供了重要的因子，作者猜想上皮隱窩的形成可以由基質細胞產(chǎn)生的因子單獨誘導，于是在培養(yǎng)體系中去除了Wnt激活劑，CHIR-99021，R-spondin 1和BMP抑制劑Noggin，發(fā)現(xiàn)在缺少這些因子的條件下的類器官組裝體和全培養(yǎng)基的類器官組裝體結構相當，證實了作者的猜想，于是后期的培養(yǎng)體系均去除了這些因子。

為了證明類器官組裝體和體內隱窩的相似性，作者通過化學誘導和免疫熒光染色等手段，首先發(fā)現(xiàn)了該模型在沒有補充Wnt誘導因子的情況下，存在與體內類似的Wnt靶基因-AXIN1干細胞的分布；接著發(fā)現(xiàn)Yap相關蛋白的表達量會隨著該模型的成熟逐漸降低，這與體內保持一致；最后通過免疫熒光圖像和單細胞RNA測序等方式，發(fā)現(xiàn)類器官組裝體有著與體內組織類似的細胞組成，比如存在許多看起來完全分化的杯狀細胞和腸內分泌細胞等等，并且可以重現(xiàn)凋亡細胞向管腔排出的現(xiàn)象。

為了闡明結腸類器官組裝體中基質細胞的多樣性，作者通過免疫熒光染色首先發(fā)現(xiàn)維持CD31的內皮細胞、神經(jīng)元細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞，這四種關鍵細胞類型的分布與結腸組織類似。接著作者針對類器官組合體中非上皮細胞進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)了存在結腸組織中的特絡細胞和滋養(yǎng)細胞。最后，作者使用單分子原位雜交評估了成纖維細胞群在類器官組裝體中的空間分布，表明該組裝體可以模擬體內結腸隱窩的上皮和間充質結構，能概括基質細胞（包括特絡細胞和滋養(yǎng)細胞樣細胞）的多樣性和空間分布。

由于特絡細胞和滋養(yǎng)細胞表達對BMP信號傳導作用相反，作者為了進一步鑒定模型中特絡細胞和滋養(yǎng)細胞的功能，使用單分子原位雜交和Q-PCR等技術，發(fā)現(xiàn)類器官組裝體的BMP激動劑-Bmp2主要在上皮細胞和基質細胞的隱窩頂部表達，逐漸向基部減少，而BMP抑制劑-Grem1表達在隱窩和基質細胞之間，這些蛋白的分布同樣與結腸組織類似。

BMP是驅動胃腸道細胞分化的關鍵因素，為了探究該模型在研究上皮和基質之間信號傳導的功能，作者通過兩種基因敲除小鼠分別構建結腸類器官組合體，發(fā)現(xiàn)在BMP信號缺失的情況下，該模型僅是襯有上皮單層的簡單球體，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)上皮細胞沒有分化，而在BMP信號存在的情況下，結果相反。證實了BMP信號傳導對上皮分化的關鍵作用。

在之前的工作中，作者發(fā)現(xiàn)在早期培養(yǎng)物中，BMP激活劑表達較低，不存在特絡細胞，而BMP抑制劑在基質區(qū)域表達較高，隨著隱窩的成熟，BMP激動劑在隱窩頂部表達增加，而BMP抑制劑卻沒有在隱窩和基質細胞之間表達，表明BMP信號傳導與基質細胞組織之間存在潛在關系。為了驗證上述觀點，作者使用BMP處理過原代結腸基質細胞和滋養(yǎng)細胞后，通過Q-PCR，發(fā)現(xiàn)特絡細胞標志物Foxl4和Wnt1a均顯著增加，而滋養(yǎng)細胞標志物Cd5和Grem34下調，證實了基質細胞對BMP信號的響應，說明來自上皮的信號能決定基質細胞的空間分布。

最后，為了探究該模型在精準醫(yī)學上的作用，作者在已成功誘導出小鼠結腸炎相關腫瘤的動物模型中，取出腫瘤組織，成功構建出結腸癌組裝體，通過HE染色和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)該組裝體與類器官形態(tài)不同，組裝體的細胞生長成不規(guī)則的脊，具有高增殖低分化的特點，類似于體內的腫瘤組織。作者還發(fā)現(xiàn)該組裝體與腫瘤組織中YAP1的高表達，表示兩者具有類似胎兒的更加原始狀態(tài)。這些結果表明該類器官組裝體能模擬結腸癌的形態(tài)特征，并用于研究腫瘤與其微環(huán)境之間的相互作用。

總而言之，作者開創(chuàng)了一種上皮細胞和基質細胞共培養(yǎng)方式，可以研究胃腸道組織的細胞間通訊和自組織，上皮細胞和基質細胞之間相互作用的信號通路，同時由于該組裝體在解剖學上比傳統(tǒng)類器官更接近和更全面地類似于體內狀態(tài)，這對胃腸道疾病的研究提供了更加優(yōu)秀的模型，為相關腫瘤疾病的臨床治療提供了新的思路。