寫在前面

????????今天推薦的是由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2019年8月9日發(fā)表于Cancer Immunology Research（2020IF：11.151，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Xueli Bai教授，研究表明USP22去泛素化CD274以抑制抗癌免疫。

研究背景

????????PD-1(CD279)–PD-L1(CD274)抑制信號對于癌癥免疫逃避至關(guān)重要，因此已成為抗癌免疫治療的主要靶點之一。有幾項研究證明了CD274的翻譯后修飾對免疫失活和抑制的有效影響，例如泛素化、磷酸化、糖基化和棕櫚?；?。然而，CD274去泛素化的調(diào)控機制仍不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者將泛素特異性蛋白酶22(USP22)鑒定為一種新型的CD274去泛素化酶。USP22直接與CD274的C末端相互作用，誘導(dǎo)其去泛素化和穩(wěn)定化。在多種癌癥類型中，USP22在肝癌中高表達，與這些患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。USP22的基因缺失以免疫系統(tǒng)依賴性方式抑制肝癌生長，增加腫瘤免疫原性和腫瘤浸潤淋巴細胞，并提高CD274靶向免疫療法和基于CDDP的化療對小鼠的治療效果。作者證明靶向USP22是增強CD274擴增癌癥的抗癌免疫的有前景的策略。

研究內(nèi)容

1.USP22與CD274相互作用并阻止其通過去泛素化降解? ? ?

????????為了研究CD274的降解是否能被DUBs逆轉(zhuǎn)，作者使用廣譜的DUB小分子抑制劑（PR-619）來處理穩(wěn)定表達Flag-CD274的293T細胞，它以劑量和時間依賴的方式減少了CD274的表達。作者選擇了幾個高度敏感的DUB作為候選進行基于結(jié)合的小型化篩選，發(fā)現(xiàn)Flag-CD274與USP22特異性強相互作用。作者還通過不同細胞中的內(nèi)源性免疫沉淀進行驗證。使用純化的重組蛋白進行的體外下拉分析表明USP22直接與CD274的C端的細胞質(zhì)尾部和跨膜區(qū)結(jié)合。CD274在其C端具有三個不同的功能域；因此作者探究USP22結(jié)合的精確位點。共免疫沉淀結(jié)果強烈表明USP22與CD274的最后五個氨基酸（HLEET）相互作用。因為USP22是一種成熟的泛素特異性蛋白酶，作者認為CD274可能是其潛在的底物。作者在USP22擴增的HCC細胞系（HepG2）中通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的KO敲除了內(nèi)源性USP22，三個該單克隆都表現(xiàn)出降低的CD274表達。相比之下，USP22的過表達導(dǎo)致CD274蛋白水平增加。

????????鑒于CD274的穩(wěn)定性受到細胞周期依賴性細胞周期蛋白D-CDK4激酶的負向調(diào)節(jié)，并且USP22也參與細胞周期進程，作者進一步測試了CDK4相關(guān)對USP22-CD274調(diào)節(jié)的影響。作者實驗發(fā)現(xiàn)CDKN2A（細胞周期蛋白D-CDK4的上游抑制劑）或FZR1（細胞周期蛋白D-CDK4的下游銜接蛋白）的KD對USP22過表達導(dǎo)致的CD274上調(diào)沒有影響?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明USP22以獨立于CDK4的方式穩(wěn)定CD274。為了確定蛋白質(zhì)保護作用是否取決于USP22的催化活性，將WT、無催化活性的突變體(C185A)和USP22的含UCH結(jié)構(gòu)域(UCH)分別轉(zhuǎn)染到USP22 KO HepG2細胞中。只有WT USP22的重新表達才能恢復(fù)USP22缺陷細胞中的CD274水平，這表明USP22通過其去泛素化相關(guān)的酶活性調(diào)節(jié)CD274蛋白的穩(wěn)定性。為了了解USP22對CD274蛋白表達的積極影響，作者探究了USP22是否通過蛋白水解影響CD274降解。通過與MG132（蛋白酶體抑制劑）孵育，可以恢復(fù)USP22敲低或過度表達的細胞中改變的CD274水平。這些結(jié)果表明USP22阻止了CD274的蛋白酶體降解。與該結(jié)論一致，CD274的半衰期在USP22 KO細胞中顯著縮短，但在USP22過表達細胞中大大延長。作者試圖確定USP22是否催化了CD274的去泛素化并發(fā)現(xiàn)USP22敲低誘導(dǎo)體內(nèi)泛素化CD274的增加，在回補USP22后大大減少。最后，去泛素化分析證實了WT USP22，而不是無活性的CA突變體，可以在體外直接去泛素化純化的泛素化CD274蛋白。

研究結(jié)論：USP22是CD274的去泛素化蛋白酶。

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2.USP22通過CD274抑制腫瘤免疫原性和抗腫瘤治療? ?

????????為了研究USP22-CD274軸的潛在病理生理學(xué)意義，作者生成了CD274過表達的USP22 KO細胞，以及USP22和CD274 DKO細胞。作者發(fā)現(xiàn)CD274的過表達和敲低都沒有對USP22控制的細胞增殖、活力或集落形成具有任何顯著的促進或抑制作用。因此，USP22介導(dǎo)的癌細胞體外生長不需要CD274。作者分析了TCGA的癌癥研究中 68,054份樣本中USP22和CD274在臨床癌癥病例中的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)USP22和CD274具有頻繁的基因改變和顯著的發(fā)生趨勢。USP22僅在肝HCC（LIHC）和膽管癌（CHOL）中高表達。這些數(shù)據(jù)表明肝癌是研究體內(nèi)USP22-CD274調(diào)節(jié)的理想模型。

????????為了探索USP22在有無功能性免疫系統(tǒng)的情況下對腫瘤生長的影響以及對免疫檢查點阻斷和常規(guī)化療的反應(yīng)，作者利用WT和USP22 KO H22小鼠肝癌細胞系。作者觀察到，在嚴重免疫缺陷的NCG小鼠中，USP22 KO細胞衍生的腫瘤生長與WT對照細胞非常相似。相比之下，作者發(fā)現(xiàn)USP22 KO在很大程度上限制了免疫活性C57BL/6小鼠的腫瘤生長，這表明USP22在腫瘤免疫逃避中起著關(guān)鍵作用。為了進一步評估USP22抑制的免疫原性，分別皮下注射配對的WT和USP22 KO細胞。進入相同免疫活性C57BL/6小鼠的相對側(cè)。結(jié)果顯示W(wǎng)T腫瘤的生長類似于USP22 KO腫瘤。由于USP22是CD274的DUB，其消耗誘導(dǎo)的CD274不穩(wěn)定可能會改善CD274靶向免疫療法。正如預(yù)期的那樣，與WT腫瘤相比，抗CD274抗體在USP22 KO腫瘤中的治療效率顯著提高，表明USP22敲除促進了抗腫瘤免疫反應(yīng)。為了研究USP22缺失和常規(guī)化療之間的協(xié)同作用，用順鉑(CDDP)治療攜帶WT和USP22 KO腫瘤的C57BL/6小鼠。與WT腫瘤相比，USP22敲除提高了CDDP的治療效果。CD274 KO H22細胞中USP22的敲除仍然能夠抑制免疫活性小鼠的腫瘤生長，這意味著不能完全忽略USP22的CD274獨立作用。

研究結(jié)論：USP22敲除可以增強抗癌免疫。

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3.USP22-CD274軸控制TIL和癌癥預(yù)后? ? ?

????????由于CD274對TIL有很大影響，而TIL對癌癥免疫療法的功效至關(guān)重要，作者在腫瘤模型中測試了CD274表達以及TIL的絕對數(shù)量和功能。正如預(yù)期的那樣，在NCG小鼠、C57BL/6小鼠、與USP22 KO和WT腫瘤共同接種的C57BL/6小鼠、CD274靶向免疫治療期間或基于CDDP的化療期間，來自USP22 KO H22細胞的腫瘤中CD274表達水平明顯下調(diào)。

????????在單獨接種的小鼠、與USP22 KO和WT腫瘤共同接種的小鼠、免疫治療期間或化療期間，CD3t TILs的絕對數(shù)量和CD8t顆粒酶B（GZMB）t細胞在CD3t TILs中的相對比例都大大增加。

????????為了確定 USP22 是否可能是肝癌的預(yù)后標志物，作者進行了Kaplan–Meier生存分析，發(fā)現(xiàn) USP22 的高表達與肝癌患者較差的總生存期 (OS) 相關(guān)，以及是否接受索拉非尼治療有關(guān)。USP22的生存相關(guān)性與肝炎病毒感染或飲酒無關(guān)。為了進一步證實USP22在人類樣本中CD274調(diào)節(jié)中的作用，作者測試了這兩種基因在HCC中的表達。在蛋白質(zhì)水平上，USP22的表達與CD274的表達密切相關(guān)。有趣的是，使用內(nèi)部HCC cDNA庫，USP22和CD274在mRNA水平上的表達之間存在正相關(guān)。

研究結(jié)論：揭示了USP22、CD274和癌癥免疫之間的新聯(lián)系。

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結(jié)論與討論

????????作者提出了一個工作模型來總結(jié)其發(fā)現(xiàn)。CD274的翻譯后修飾(PTM)被假設(shè)是一種抵抗免疫檢查點阻斷的機制。CD274受多種翻譯后修飾的調(diào)控，例如泛素化、磷酸化、糖基化和棕櫚酰化。CD274 PTM靶向策略在激活抗腫瘤免疫方面取得了重要進展，尤其是通過靶向糖基化CD274。在這項研究中，作者專注于CD274去泛素化的控制，這被認為是維持其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和抑制功能的保護機制。作者確定USP22是一種新型的CD274去泛素化酶，并強調(diào)靶向USP22在肝癌治療尤其是在挽救免疫失活方面的重要性。

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Thank you!

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31399419/