前言

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是一種高致死率的癌癥，預(yù)后不佳。由于高度免疫抑制的腫瘤微環(huán)境（TME），免疫療法不能改善PDAC患者的臨床表現(xiàn)。而有研究表明，腸道菌群可以決定癌癥的進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)，比如來(lái)自長(zhǎng)期PDAC患者（可能具有一定的抗腫瘤因子參與）的腸道菌群具有一定的抗腫瘤作用。這種抗腫瘤作用可能與TME的免疫反應(yīng)有關(guān)。腸道菌群可以產(chǎn)生多種代謝物，比如促炎代謝物氧化三甲胺（TMAO），由食物中膽堿經(jīng)腸道菌的膽堿TMA裂解酶轉(zhuǎn)化為T(mén)MA，而后TMA進(jìn)入門(mén)靜脈，在肝臟中氧化為T(mén)MAO。研究表明，TMAO可以激活免疫。因此，本篇作者采用多組學(xué)的方法對(duì)TMAO抗腫瘤的效果及機(jī)制展開(kāi)研究。

2022年9月,費(fèi)城Wistar研究所的Rahul S.Shinde團(tuán)隊(duì)在Science Immunology（IF：30.63）發(fā)表了題為“The microbiome-derived metabolite TMAO drives immune activation and boosts responses to immune checkpoint blockade in pancreatic cancer”的研究成果。該文章使用非靶向代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)（scRNA-seq）、熒光流式對(duì)TMAO對(duì)PDAC腫瘤生長(zhǎng)以及巨噬細(xì)胞的影響展開(kāi)研究。

研究思路

研究結(jié)果

1、腸道微生物衍生的TMAO驅(qū)動(dòng)PDAC中TME的免疫激活并減少腫瘤生長(zhǎng)

首先作者采用抗生素甲硝唑改變小鼠腸道菌群，以觀察腫瘤生長(zhǎng)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲硝唑可以明顯增加腫瘤大小（圖1A）。通過(guò)對(duì)小鼠血清的非靶代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，受影響最大的是TMAO，平均減少了約73倍（圖1B）。通過(guò)腹腔注射外源TMAO或者TMA，發(fā)現(xiàn)腫瘤大小和重量明顯減少。

通過(guò)熒光流式分析發(fā)現(xiàn)，TMAO或TMA處理后，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）中主要組織相容性復(fù)合體I類（MHCI）、MHCII和CD86等刺激性標(biāo)志物的表達(dá)增加；同時(shí)，抗炎標(biāo)志物Arg1的表達(dá)明顯減少，共同表明向免疫刺激性TAM表型轉(zhuǎn)變（圖1E和F）。效應(yīng)性T細(xì)胞的激活大幅增加，表現(xiàn)為IFN-γTNF-αCD8和CD4 T細(xì)胞的百分比增加，以及CD8和CD4v+T細(xì)胞上的激活標(biāo)志物CD44增加（圖1G）。

此外，血清中的TMAO水平與IFN-γTNF-αCD8 T細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)，與腫瘤重量呈負(fù)相關(guān)。此外，TMAO也激活了小鼠外周器官及淋巴組織的免疫。這些結(jié)果說(shuō)明TMAO或TMA可能通過(guò)重新配置腫瘤環(huán)境，使其處于免疫激活狀態(tài)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。誘導(dǎo)外周組織的免疫激活可能有助于TMAO的腫瘤抑制作用。

圖1 | TMAO或TMA驅(qū)動(dòng)PDAC的TME中免疫激活

2、飲食中的膽堿或腸道菌TMA裂解酶可以復(fù)制TMAO導(dǎo)致的表型

隨后作者通過(guò)向食物中增加膽堿來(lái)驗(yàn)證這一結(jié)果。通過(guò)非靶代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充膽堿的小鼠中TMAO和TMA的水平增加，且與PDAC尺寸的明顯減少有關(guān)（圖2A和B）。而且，補(bǔ)充膽堿導(dǎo)致的免疫刺激作用與直接給予TMAO相似。具體來(lái)說(shuō)，在TAMs上MHCI和MHCII等刺激標(biāo)志物的表達(dá)明顯增加（圖2c）。也觀察到其他先天性免疫細(xì)胞的激活標(biāo)記增加，包括CD11bLy6CLy6G-單核骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）（M-MDSC）、CD11b Ly6CLy6G多核MDSCs（PMN-MDSC）和抗原呈遞的CD103+樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）。這些分析還顯示了活化的CD8和CD4T細(xì)胞的明顯增加，如IFN-γTNF-αCD8和CD4T細(xì)胞百分比的增加與活化標(biāo)志物CD69的增加有關(guān)（圖2D和圖S4D和E）。而TMAO的產(chǎn)生取決于腸道菌群酶CutC/D的活性。

為研究CutC/D酶活性是否是TMAO抗腫瘤作用所必需的，作者使用CutC/D酶抑制劑氟甲基膽堿（FMC）抑制CutC/D活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MC處理后明顯降低了循環(huán)TMAO水平，與甲硝唑相似（圖2F）。與對(duì)照組相比，F(xiàn)MC治療還與PDAC負(fù)擔(dān)的明顯增加有關(guān)（圖2G）。此外，F(xiàn)MC明顯增加了Arg1的表達(dá)，同時(shí)減少了TAMs上的MHCII，表明TAM免疫刺激表型的整體減少（圖2H）。CD103DCs的免疫刺激表型也減少了，表現(xiàn)為MHCI和IL-12p40表達(dá)的減少（圖S4G）。最后，IFN-γTNF-αCD8和CD4 T細(xì)胞的百分比明顯下降，這表明效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)下降（圖2I）。這些數(shù)據(jù)表明，TMAO誘導(dǎo)的TAMs和其他免疫細(xì)胞的免疫刺激表型至少部分是由于腸道細(xì)菌酶CutC/D的活性。

圖2 | 飲食及腸道菌群干預(yù)復(fù)制了TMAO的抗腫瘤效果

3、TMAO驅(qū)動(dòng)了PDAC免疫浸潤(rùn)中的抗腫瘤轉(zhuǎn)錄作用

接下來(lái)，作者為了解TMAO對(duì)TAMs的影響，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-seq對(duì)TAMs進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMAO處理組的1736個(gè)基因轉(zhuǎn)錄物發(fā)生了明顯的變化，與對(duì)照組相比向免疫刺激狀態(tài)的轉(zhuǎn)變相一致。上調(diào)的基因包括許多參與炎癥的基因，如Nr4a3、H-Q5、H2-Q6、Irf3、Irf5、Acod1、Def6和Ccrl2（圖3A）。下調(diào)的基因包括Trim29、Tgfb3、Cyp1b1、Pparg和Mmp12（圖3A）。

為進(jìn)一步了解TMAO對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄影響，作者采用scRNA-seq對(duì)CD45免疫細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個(gè)免疫細(xì)胞亞群被分隔成14種具有不同轉(zhuǎn)錄譜的細(xì)胞類型（圖3C）。此外，發(fā)現(xiàn)免疫刺激標(biāo)志物增加，包括I型IFN反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器（如NF-κB、IRF7和STAT1）、炎癥細(xì)胞因子（如IL-15、IL-12、IFN-β和IL-1β）和成本刺激分子（如CD40），而免疫抑制標(biāo)志物（如AHR、VEGF和IL-10）則減少（圖3E）。另一方面，TMAO也影響了T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，被激活的功能包括CD8T淋巴細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的免疫反應(yīng)、抗原表達(dá)和腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞死亡，被抑制的功能包括調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤細(xì)胞的增殖、纖維組織腫瘤和骨髓細(xì)胞的增殖（圖3F）。

為進(jìn)一步了解TMAO的抗腫瘤作用是否需要TAMs和/或CD8T細(xì)胞的參與。作者在PDAC小鼠中使用抗CSF1加氯膦酸鈉耗盡巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)耗盡TAMs后，與對(duì)照組相比，TMAO不再減少腫瘤負(fù)擔(dān)，這表明TAMs可能參與了TMAO的抗腫瘤作用（圖3G）。這些結(jié)果表明，TMAO通過(guò)重新配置TME中的免疫細(xì)胞，使其處于更活躍的狀態(tài)，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。

圖3 | TMAO驅(qū)動(dòng)了PDAC中TME的免疫激活

4、TMAO介導(dǎo)巨噬細(xì)胞獲得免疫刺激表型

隨后，作者想確定TMAO是否對(duì)巨噬細(xì)胞的功能表型有直接影響。通過(guò)使用脂多糖或同時(shí)添加IFN-γ在有TMAO存在或者不存在的情況下，處理小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDM）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMAO提高了促炎癥細(xì)胞因子（IL-6和IL-12p40）的分泌，減少了抗炎癥細(xì)胞因子IL-10的分泌。

通過(guò)RNA-seq，作者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞暴露于TMAO后，超過(guò)1500個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了明顯的變化。被激活的途徑包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素（mTOR）信號(hào)、IFN信號(hào)，以及一氧化氮和ROS的產(chǎn)生，被抑制的途徑包括PPAR信號(hào)、sirtuin信號(hào)和PTEN信號(hào)。

為了解TMAO在腫瘤環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，作者將BMDM暴露在沒(méi)有或有TMAO的PDAC腫瘤調(diào)理介質(zhì)（TCM），隨后通過(guò)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，TMAO促使與免疫抑制（包括）、基質(zhì)金屬蛋白酶（包括）和細(xì)胞外基質(zhì)重塑（包括）有關(guān)的基因表達(dá)明顯下降。相反，TMAO增加了免疫刺激基因的表達(dá)（包括）。體內(nèi)TMAO也明顯增加了TAMs中I型IFN途徑的調(diào)節(jié)因子（如）（圖3B和E）?？傊@些結(jié)果表明，TMAO誘導(dǎo)了一種免疫刺激性巨噬細(xì)胞表型，這種表型與I型IFN反應(yīng)的增加有關(guān)；這種I型IFN反應(yīng)的增加可能是TMAO抗腫瘤作用的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

圖4 | 通過(guò)促進(jìn)I型IFN反應(yīng)激活的TMAO信號(hào)

5、TMAO增強(qiáng)了I型IFN反應(yīng)并以I型IFN依賴的方式發(fā)揮抗腫瘤作用

為了驗(yàn)證TMAO對(duì)I型IFN的激活效用。作者采用I型IFN的已知激活劑如ISD、poly（dG:dC）等刺激BMDM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISD等激活劑導(dǎo)致I型IFN反應(yīng)基因的表達(dá)增加（圖4C）。TMAO誘導(dǎo)對(duì)ISD和poly（dG:dC）的表達(dá)（圖4C），但只誘導(dǎo)對(duì)poly（dG:dC）的表達(dá)（圖4C）。TMAO還增加了活化標(biāo)志物的表面表達(dá)，包括CD86、MHCII和PDL1，以及用ISD刺激后MHCIIPDL1巨噬細(xì)胞的百分比（圖4D）。這些結(jié)果表明，TMAO增強(qiáng)了I型IFN反應(yīng)，并可能通過(guò)刺激I型IFN途徑促進(jìn)獲得免疫刺激巨噬細(xì)胞表型。

6、TMAO直接改變了巨噬細(xì)胞表型以支持T細(xì)胞反應(yīng)及降低PDAC負(fù)擔(dān)

為驗(yàn)證TMAO刺激的巨噬細(xì)胞是否也能抑制PDAC的生長(zhǎng)，作者采用TMAO刺激的巨噬細(xì)胞治療患有腫瘤的小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，接受對(duì)照組巨噬細(xì)胞的小鼠的腫瘤負(fù)擔(dān)略有增加（圖5C）。與接受對(duì)照組巨噬細(xì)胞的小鼠相比，接受TMAO刺激的巨噬細(xì)胞的腫瘤負(fù)擔(dān)平均下降了2.4倍以上（圖5C）。接受TMAO刺激的巨噬細(xì)胞的小鼠顯示出強(qiáng)大的活化特征，與接受對(duì)照巨噬細(xì)胞的小鼠相比，CD8和CD4T細(xì)胞上的IFN-γ、Ki-67、CD103和CD44明顯上調(diào)（圖5D和E）。這些結(jié)果共同表明，TMAO將巨噬細(xì)胞塑造為一種表型，增強(qiáng)了效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，減少了PDAC生長(zhǎng)。

圖5 | TMAO通過(guò)促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞激活以塑造巨噬細(xì)胞反應(yīng)并降低PDAC生長(zhǎng)

7、人類巨噬細(xì)胞匯總也發(fā)現(xiàn)了TMAO的促炎作用

隨后，作者在人類巨噬細(xì)胞上驗(yàn)證TMAO的促炎癥作用。發(fā)現(xiàn)，在TCM刺激的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中加入TMAO，可顯著增加促炎癥基因（包括IFNR1、IL-6、CCL-5、TNFA和IL-1B等）的表達(dá)，并顯著降低抗炎癥基因IL-10的表達(dá)（圖5F）。這些結(jié)果表明，TMAO也推動(dòng)了人類巨噬細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)，并可能在人類中以類似于在小鼠中觀察到的方式發(fā)揮作用。

8、TMAO使PDAC對(duì)免疫檢查點(diǎn)治療敏感并提高PDAC小鼠生存率

由于在PDAC小鼠中施用TMAO或TMA，或在飲食中補(bǔ)充膽堿，都會(huì)明顯增加PD1Tim3CD8T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)（圖6A和B），這表明，將TMAO與anti-PD1或anti-Tim3結(jié)合起來(lái)，可能比單獨(dú)使用任何一種干預(yù)措施都更有效。因此，作者對(duì)此展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的anti-PD1并沒(méi)有減少腫瘤負(fù)擔(dān)；然而，與單獨(dú)的TMAO或?qū)φ战M相比，anti-PD1加TMAO的組合確實(shí)明顯減少了腫瘤重量（圖6C）。與單一治療或未治療的對(duì)照組相比，聯(lián)合治療組的骨髓細(xì)胞（包括TAMs、MDSCs和CD103 DCs）的細(xì)胞表面標(biāo)志物MHCI明顯增加，這表明聯(lián)合治療增加了這些細(xì)胞群的免疫刺激表型（圖6D）。這與顯著的效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，包括CD44Ki-67以及IFN-γTNF-αCD8和CD4T細(xì)胞百分比的明顯增加，表明T細(xì)胞的大量增殖和激活狀態(tài)（圖6E）。此外，膽堿代謝物TMAO或TMA與ICB（anti-PD1加anti-Tim3）相結(jié)合時(shí)，可改善PDAC對(duì)ICB的反應(yīng)性和腫瘤小鼠的生存率（圖6G和H）。

圖6 | 施用TMAO或TMA增強(qiáng)了PDAC對(duì)ICB的反應(yīng)

9、產(chǎn)TMA菌群豐度及CutC基因表達(dá)與PDAC患者對(duì)治療反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)

最后，作者通過(guò)分析以往研究中PDAC長(zhǎng)期生存者和短期生存者中的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)，與短期生存者相比，長(zhǎng)期生存者中Bacillus和Paenibacillus的相對(duì)豐度明顯更高（圖7A）。由于本文之前的研究表明，作者假設(shè)腫瘤對(duì)anti-PD1的臨床反應(yīng)可能與含有CutC的細(xì)菌的存在或糞便微生物組中CutC基因的表達(dá)相關(guān)。通過(guò)利用他人的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與PD1無(wú)反應(yīng)者相比，反應(yīng)者中含有CutC的Bacillus的相對(duì)豐度更高（圖7B）。還發(fā)現(xiàn)，18個(gè)細(xì)菌菌株的anti-PD1反應(yīng)和CutC表達(dá)之間的重要關(guān)聯(lián)，包括（圖7C）。這些菌株屬于兩個(gè)細(xì)菌科，即梭菌科（Clostridiaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae），與無(wú)反應(yīng)者相比，它們?cè)诜磻?yīng)者中含量豐富（圖7D）。此外，反應(yīng)者中CutC的表達(dá)明顯增加（圖7E），而且CutC的高表達(dá)與anti-PD1后總生存率的提高明顯相關(guān)（圖7F）。這些結(jié)果共同表明，含有CutC的細(xì)菌的存在和CutC基因的表達(dá)與癌癥患者的生存率提高和對(duì)anti-PD1的反應(yīng)有關(guān)。

圖7 | 含CutC細(xì)菌的豐度以及提高CutC基因表達(dá)可以促進(jìn)PDAC患者生存并提高對(duì)anti-PD1反應(yīng)

相關(guān)討論

腸道微生物衍生的代謝物TMAO和抗PDAC腫瘤免疫反應(yīng)之間有一種未曾預(yù)見(jiàn)的聯(lián)系。TMAO誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的免疫刺激表型，增強(qiáng)了效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，并使PDAC對(duì)ICB有反應(yīng)。在臨床上，含有CutC的細(xì)菌與anti-PD1的反應(yīng)改善有關(guān)。

小鹿推薦

TMAO可以說(shuō)是近年來(lái)比較熱的小分子代謝物，大多研究均與其促炎的作用有關(guān)，比如TMAO與動(dòng)脈粥樣硬化等。本研究創(chuàng)造性地將TMAO與PDAC腫瘤聯(lián)系起來(lái)，采用多組學(xué)聯(lián)合的手段，如非靶代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，發(fā)現(xiàn)TMAO可以通過(guò)促炎的作用發(fā)揮抗腫瘤功能，并深入探討了TMAO抗腫瘤的機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解腫瘤治療機(jī)制，腫瘤與炎癥的關(guān)系，以及TMAO與腫瘤免疫的關(guān)系提供了新的思路和見(jiàn)解。

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