“基因敲除CHO細(xì)胞系”（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）是源自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞系技術(shù)。中國(guó)倉(cāng)鼠是一種流行的實(shí)驗(yàn)室哺乳動(dòng)物，部分原因是它們的體積小且染色體數(shù)少，使其成為組織培養(yǎng)和放射學(xué)研究的良好模型。CHO細(xì)胞是生物學(xué)，醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型。另外，它們通常用于商業(yè)目的以產(chǎn)生治療性重組蛋白。對(duì)治療性蛋白質(zhì)的需求不斷增長(zhǎng)，導(dǎo)致了在CHO表達(dá)系統(tǒng)中促進(jìn)高質(zhì)量和高生產(chǎn)率的技術(shù)的發(fā)展。已經(jīng)建立了CHO培養(yǎng)過(guò)程，使用CHO細(xì)胞生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的成本與微生物培養(yǎng)的成本相當(dāng)。

使用CRISPR/Cas9和熒光富集產(chǎn)生三重敲除CHO細(xì)胞系

先前已經(jīng)證明，CRISPR / Cas9基因編輯技術(shù)是用于CHO細(xì)胞基因破壞的有效工具。穩(wěn)定的細(xì)胞系在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)在CHO細(xì)胞的多個(gè)環(huán)境被同時(shí)破壞FUT8，BAK和BAX，進(jìn)一步證明了CRISPR/Cas9基因組編輯的適用性和效率。為了從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞庫(kù)中分離出表達(dá)Cas9的細(xì)胞，GFP通過(guò)2A肽與Cas9核酸酶連接。使用這種方法，在三個(gè)基因組位點(diǎn)產(chǎn)生的平均插入缺失頻率從富集前的11％增加到富集后的68％。盡管在富集的細(xì)胞池中存在大量的基因組編輯事件，但從脫靶預(yù)測(cè)然后進(jìn)行深度測(cè)序均未觀察到明顯的脫靶效應(yīng)。對(duì)富集的多重細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選，并對(duì)97個(gè)克隆進(jìn)行深測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)單基因，23個(gè)雙基因和34個(gè)三基因破壞的細(xì)胞系。如預(yù)期所選的，對(duì)選定的潛在三方敲除克隆的進(jìn)一步表征證實(shí)了Bak和Bax蛋白的去除并破壞了巖藻糖基化活性。與野生型CHO-S細(xì)胞相比，敲除細(xì)胞系顯示出對(duì)凋亡的增強(qiáng)抵抗力?？傊?，與CRISPR/Cas9的多路復(fù)用可以進(jìn)一步加速CHO細(xì)胞中的基因組工程工作。

敲除難以去除的CHO宿主細(xì)胞蛋白脂蛋白脂肪酶，以提高單克隆抗體制劑中山梨酸酯的穩(wěn)定性

盡管大多數(shù)宿主細(xì)胞蛋白（HCP）雜質(zhì)在典型的下游純化過(guò)程中已被有效去除，但是一小部分HCP尤其具有挑戰(zhàn)性。先前的研究已經(jīng)確定了由于多種原因而具有挑戰(zhàn)性的HCP。脂蛋白脂肪酶（LPL）是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）HCP，具有水解甘油三酸酯中的酯的功能。它是先前研究中確定的十種HCP之一，很容易保留在下游的加工中。由于聚山梨酯和甘油三酸酯之間的結(jié)構(gòu)相似性，LPL可能會(huì)使最終產(chǎn)品配方中的聚山梨酯80（PS-80）和聚山梨酯20（PS-20）降解。在這項(xiàng)工作中，發(fā)現(xiàn)重組LPL在一系列mAb制劑的典型溶液條件下對(duì)PS-80和PS-20具有酶促活性。使用CRISPR和TALEN技術(shù)創(chuàng)建LPL基因敲除CHO細(xì)胞。與野生型樣品相比，所得細(xì)胞培養(yǎng)物收獲物證明聚山梨酯降解顯著降低，而對(duì)細(xì)胞生存力沒(méi)有顯著影響。

優(yōu)化CRISPR / Cas9策略，可在CHO細(xì)胞中進(jìn)行同源性導(dǎo)向的轉(zhuǎn)基因多靶點(diǎn)整合

特定于站點(diǎn)的整合已成為一種精準(zhǔn)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系工程和可預(yù)測(cè)的細(xì)胞系發(fā)育（CLD）的前途和策略中。具有同源性定向修復(fù)（HDR）途徑的CRISPR / Cas9能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因精確整合到目標(biāo)基因組位點(diǎn)中。然而，對(duì)轉(zhuǎn)基因的HDR介導(dǎo)的靶向整合（TI）固有的頑固性導(dǎo)致靶向效率低下，因此需要選擇過(guò)程才能在CHO細(xì)胞中找到靶向整合體。研究人員使用基于啟動(dòng)子-Trap的單或雙敲入（KI）監(jiān)視系統(tǒng)探索了幾個(gè)影響目標(biāo)效率的參數(shù)。與傳統(tǒng)的環(huán)形供體質(zhì)粒相比，增加了單向?qū)NA識(shí)別序列對(duì)供體模板設(shè)計(jì)進(jìn)行的簡(jiǎn)單更改，可顯著提高KI效率（2.9–36.0倍），取決于整合位點(diǎn)和細(xì)胞培養(yǎng)模式，可提高KI效率。此外，順序和同時(shí)進(jìn)行的KI策略使我們無(wú)需額外的富集程序即可獲得約1-4％的雙KI細(xì)胞群體。因此，這種簡(jiǎn)單的優(yōu)化策略不僅可以在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的TI，而且還為在一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中多重KI的適用性鋪平了道路，而無(wú)需順序和獨(dú)立的CHO-CLD程序。

Ubigene具有400多種類(lèi)型的原代細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和不同物種（例如人，大鼠和小鼠）的成纖維細(xì)胞。我們可以為每個(gè)主單元提供驗(yàn)證報(bào)告。我們的原代細(xì)胞已被許多研究機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)廣泛使用。

Reference

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基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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