實驗目的：

本實驗方案通過利用微滴/微球制備儀，以Drop-Surf微滴生成油為油相，以5%殼聚糖為水相制備高單分散的微滴，并與接收液油相中的戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現(xiàn)微滴的固化。最終獲得具有極高的單分散性的殼聚糖微球(CV<5%)。

引言：

殼聚糖是一種功能線性聚合物，是由甲殼素部分去乙酰化而得[1-3]。因其來源廣泛、無毒、價格低廉、良好的生物相容性和可降解而備受關(guān)注。近年來，殼聚糖作為一種新型功能材料，以纖維、膜、微球和膠囊等形式在蛋白吸附分離、催化劑載體、酶的固定化、重金屬吸附和藥物釋放等方面具有很大的應用潛力[2]。此外，殼聚糖在每個C6原子單元上都有一個游離的氨基，這使得殼聚糖可以與醛基發(fā)生Schiff堿反應，且在這一反應過程中生成的C=N鍵發(fā)生n-π*躍遷產(chǎn)生自發(fā)熒光[2]。而這種熒光恰恰可以應用于血液循環(huán)追蹤、細胞外基質(zhì)表征、體內(nèi)細胞成像等領(lǐng)域。因此，殼聚糖在生物、醫(yī)藥、化學和環(huán)境等領(lǐng)域都有良好的應用前景。

殼聚糖微球粒徑的均一度控制對其在生物、醫(yī)藥和催化等領(lǐng)域的成功應用至關(guān)重要。目前制備殼聚糖微球的方法有乳化固化、簡單凝聚、復合凝聚和膜乳化等[2,4]。雖然這些技術(shù)完全可行，但也存在著很大的缺點，如產(chǎn)率不穩(wěn)定、程序復雜、粒徑分布不均和重復性差等。因此，開發(fā)一種可重復、粒徑及均勻度可控的殼聚糖微球制備技術(shù)是其成功應用的必要條件。FluidicLab微滴制備平臺運用液滴微流控技術(shù)，通過微滴/微球制備儀制備高度均一的殼聚糖微滴，再與戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現(xiàn)微滴的固化，最終得到殼聚糖微球。該法操作簡便，樣品利用率高，制備得到的微球單分散性高(CV<5%)，具有較好重復性。

實驗材料：

試劑：

微滴生成油(Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)

破乳劑(Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)

殼聚糖(FluidicLab)

冰乙酸(Macklin, A801295-500 mL)

戊二醛(50%, Aladdin, G105905-500 mL)?

耗材：

15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干

1.5 mL離心管若干

內(nèi)/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭

10 mL和20 mL透明玻璃瓶若干

0.22 μm針式過濾器(PTFE材質(zhì))若干

10 mL注射器若干

芯片夾具：

PDMS-FF-100 μm 芯片（FluidicLab）

PDMS標準芯片夾具

設(shè)備：

Fluidiclab微滴/微球制備儀(兩通道)

輔助設(shè)備：

電腦(Win10 以上系統(tǒng))

高速離心機(湖南湘儀, H1850)

普通光學顯微鏡(用于測微球粒徑)

實驗步驟：

1.?試劑配制：

|a、5%(wt%)殼聚糖水溶液：

將0.5 g殼聚糖加入到約9.3 mL的超純水中，并加入200 μL (約0.2 g)冰乙酸輔助溶解，振蕩放置于85 ℃的鼓風干燥箱中加熱溶解；待完全溶解后用0.22 μm的針式過濾器過濾備用。

b、?1%戊二醛油相溶液：

取490 μL微滴生成油，加入體積為10 μL的50%戊二醛，振蕩均勻備用。

2.?微滴制備：

|a、微滴/微球制備儀的安裝連接

微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：

①?用氣管依次連接“空氣壓縮機”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”；

②?將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；

③?用氣管分別將A0(壓力輸出通道一)和A1(油相15 mL儲液池)，B0(壓力輸出通道二)和B1(水相1.5 mL儲液池)連接；

④?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A1(油相15 mL儲液池)和A2(通道一流量傳感器)，B1(水相1.5 mL儲液池)和B2(通道二流量傳感器)連接；

⑤?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A2(通道一流量傳感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量傳感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)連接；

⑥?C為標準PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；

⑦?用PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口D處生成的乳液導出。

|b、FluidicLabSuite軟件的安裝和設(shè)備的添加：

FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分；

|c、殼聚糖微液滴的制備：

具體操作步驟如下可參考以下視頻：

微流控應用：殼聚糖微球制備 保姆級實驗教程-FluidicLab微流控實驗室

① 分別在15 mL油相儲液池(通道一)和1.5 mL水相儲液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 5%的殼聚糖水溶液；

② FluidicLabSuite軟件的設(shè)備添加參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite軟件的設(shè)備添加”的部分(相機和流量傳感器僅需添加一次)；

③ 打開空氣壓縮機和氣源處理裝置開關(guān)；

④ 在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；

⑤ 在電腦端設(shè)置通道一壓力(油相，如150 mbar)和通道二壓力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，壓力更大)排出管路和芯片中的空氣；

⑥ 待管路和芯片中完全填充液體后(空氣被完全排出)；將整個系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設(shè)置通道一(油相)和通道二(水相)流速分別為20和5 μL/min；

⑦ 調(diào)整反饋值(Feedback)快速達到設(shè)定流速，并實現(xiàn)流速的穩(wěn)定輸出；

⑧ 用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；

⑨ 待微滴生成均勻后，即可開始接收至裝有1%戊二醛油相溶液的1.5 mL離心管中；

⑩ 20 min后停止收集，密封于離心管中，輕微振蕩加快微滴固化，隨后靜置一段時間。

3.殼聚糖微球的破乳清洗：

具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴生成儀制備殼聚糖微球”)：

微流控應用：殼聚糖微球制備 保姆級實驗教程-FluidicLab微流控實驗室

① 取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；

② 按V球：V破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；

③ 2500 rpm離心處理1 min，并取出底部破乳劑；

④ 重復上述②和③操作；

⑤ 最終得到固化后的殼聚糖微球。

4、微滴/微球制備儀清洗：

微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導卡”。

結(jié)果與討論：

剛接收的微滴平均粒徑為107.53 μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.14%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

通過與戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現(xiàn)微滴的固化，最終獲得的殼聚糖微球平均粒徑為101.67 μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.53%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

參考文獻：

[1] Zhao?H., et al.?A novel microfluidic approach for monodispersed chitosan microspheres with enhanced autofluorescence, Chem.?Eng.?J., 215–216, 784-790 (2013).?

[2] Xu, J.H., et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan Microspheres with Controllable Structures. Adv.?Healthcare Mater., 1,?106-111?(2012).

[3] Zhu?Y., et al. Microfluidic synthesis of thiourea modified chitosan microsphere of high specific surface area for heavy metal wastewater treatment,?Chin. Chem. Lett.,28, 633-641?(2016).

[4]?Xu, J.H.,?et al.?Preparation of monodispersed chitosan microspheres and?in situ?encapsulation of BSA in a co-axial microfluidic device.?Biomed Microdevices,?11, 243–249 (2009).

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