快速內(nèi)切酶XhoI背景：

FlyCut? 酶是一系列能夠快速消化DNA的工程限制性酶。所有FlyCut?酶在通用CutOne中顯示出優(yōu)異的活性? 和CutOne? 彩色緩沖液，能夠在5~15分鐘內(nèi)消化DNA。這使得任何限制性酶的組合都能在一個反應(yīng)管中同時工作，并消除了連續(xù)消化的需要。FlyCut? 酶已通過多項嚴(yán)格的質(zhì)量控制，可用于消化質(zhì)粒、基因組和病毒DNA以及PCR產(chǎn)物。CutOne??Color Buffer包括密度試劑以及紅色和黃色跟蹤染料，可以將反應(yīng)混合物直接裝載在凝膠上。CutOne的紅色染料? 彩色緩沖液在1%瓊脂糖凝膠中與2.5kb雙鏈DNA片段一起遷移，黃色染料在1%瓊脂凝膠中與10bp雙鏈DNA碎片一起遷移。

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艾美捷快速內(nèi)切酶XhoI：

Cat #: C-BSM583

Size: 500 rxns

Storage: -20°C

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快速內(nèi)切酶XhoI組成：

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推薦反應(yīng)條件：

1x CutOne“緩沖液；在37°C下培養(yǎng)；有關(guān)反應(yīng)設(shè)置，請參閱“快速DNA消化方案”。

熱滅活

在80°C下培養(yǎng)20分鐘。

質(zhì)量控制：

功能測試

A20μl在含有1μgλDNA（Hindli消化物）和1μl FlyCut’’Xhol的CutOne“緩沖液中的反應(yīng)在37℃下孵育15分鐘，通過瓊脂糖凝膠電泳確定完全消化。

長時間培養(yǎng)/星形活性測定

在含有1μgλDNA（HindlI消化物）和1μl FlyCut“”Xhol的CutOne“”緩沖液中，在37℃下孵育3小時，20μl反應(yīng)產(chǎn)生瓊脂糖凝膠電泳測定的無可檢測核酸酶降解的DNA模式。較長的孵化時間可能導(dǎo)致恒星活動。

結(jié)扎和清算

在37℃下用FlyCut“”Xhol消化10倍后，>95%的DNA片段可以在22℃下與T4 DNA配體連接。在這些連接的片段中，通過瓊脂糖凝膠電泳測定，>95%可以用FlyCut“Xhol重新切割。

非特異性核酸內(nèi)切酶活性

在含有1μg超螺旋質(zhì)粒和1μl FlyCut“”Xhol的CutOne“”緩沖液中進(jìn)行20μl反應(yīng)，在37℃下培養(yǎng)4小時，通過瓊脂糖凝膠電泳測定，轉(zhuǎn)化為刻痕或線性形式的轉(zhuǎn)化率<10%。

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藍(lán)/白篩選試驗：

用1μl FlyCut消化含有l(wèi)acZα基因的合適載體??XhoI。將消化產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在含有X-Gal、IPTG和適當(dāng)抗生素的Luria Bertani培養(yǎng)板上，成功連接的β-半乳糖苷酶基因可以表達(dá)并產(chǎn)生藍(lán)色菌落，而中斷基因（即降解的DNA末端）產(chǎn)生白色菌落。FlyCut? 限制性內(nèi)切酶必須產(chǎn)生少于1%的白色菌落。

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使用方法：

1.快速DNA消化方案

① 按照指示的順序在冰上混合反應(yīng)組分

② 輕輕攪拌并向下旋轉(zhuǎn)；

③在37°C下培養(yǎng)15分鐘（質(zhì)粒DNA）或15～30分鐘（PCR產(chǎn)物）或30～60分鐘（基因組DNA）；

④ 可選：在80°C下加熱20分鐘使酶失活；

⑤如果CutOne? 在反應(yīng)中使用顏色緩沖液，將反應(yīng)混合物的等分試樣直接裝入凝膠中。

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2.DNA的雙重和多重消化

①每種酶使用1μl，并適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)條件；

②反應(yīng)混合物中酶的總體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的1/10；

③如果酶需要不同的反應(yīng)溫度，從需要較低溫度的酶開始，然后加入第二種酶并在較高溫度下孵育。

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3.擴(kuò)大質(zhì)粒DNA消化反應(yīng)