一、百螢 胱天蛋白酶Caspase抑制劑 FAM-VAD-FMK工作原理

? ? ? 胱天蛋白酶Caspase抑制劑 FAM-VAD-FMK是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于Caspase的試劑，F(xiàn)AM-VAD是一種綠色熒光細(xì)胞滲透性polycaspase抑制劑靶向胱天蛋白酶1，2，3，6，8，9或10。一旦進(jìn)入細(xì)胞，所述抑制劑共價(jià)結(jié)合于胱天蛋白酶活性，其產(chǎn)生綠色熒光。當(dāng)加入到細(xì)胞群體中，F(xiàn)AM-VAD-FMK探針進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞和共價(jià)結(jié)合到駐留在胱天蛋白酶活性的異二聚體的大亞基，從而抑制進(jìn)一步的酶活性的反應(yīng)性半胱氨酸殘基。結(jié)合的標(biāo)記試劑被保留在細(xì)胞內(nèi)，而任何未結(jié)合的試劑將擴(kuò)散出細(xì)胞，并沖走。綠色熒光信號(hào)的直接測(cè)量活性胱天蛋白酶的存在于細(xì)胞中的試劑加入的時(shí)間量。含有結(jié)合的標(biāo)記試劑細(xì)胞可以通過(guò)96 - 孔板的基于熒光，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

二、百螢 胱天蛋白酶Caspase抑制劑 FAM-VAD-FMK實(shí)驗(yàn)方案

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溶液制備?

1.儲(chǔ)備溶液

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 FAM-VAD-FMK儲(chǔ)備溶液：
在DMSO中準(zhǔn)備2-5 mM的儲(chǔ)備溶液。

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樣品操作及分析

1.根據(jù)需要處理細(xì)胞。

2.通過(guò)用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲(chǔ)備溶液，制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 μM）分析溶液。

3.將等體積的處理過(guò)的細(xì)胞與2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液混合，并在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞至少1小時(shí)。

4.用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。

5.通過(guò)流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

三、百螢 胱天蛋白酶Caspase抑制劑 FAM-VAD-FMK光譜特性

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校正因子(260nm)? ? ? ?? ? 0.32

校正因子(280nm)? ? ? ? ?? 0.178

?消光系數(shù)(cm-1M-1) ??????83000

?Ex(nm)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 493

Em(nm)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ???517