基因敲除細胞系的前提條件性，是要一種用于消除某些組織（例如肝臟）中特定基因的技術(shù)。該技術(shù)對于研究個體基因在活生物體中的作用非常廣泛。它與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)不同，因為它在特定的時間針對特定的基因，而不是從一開始就將其清除。而基因敲除技術(shù)的使用消除了許多傳統(tǒng)基因敲除的副作用。在傳統(tǒng)的基因敲除中，胚胎可能由于基因突變而死亡，這使科學家無法研究成年的基因細胞。然而某些細胞組織即使可以敲除也不能單獨進行研究，因此該細胞在某些組織中必須是無活性的，而在其他組織中必須保持活性。利用這項技術(shù)，科學家可以在發(fā)育的特定階段中基因敲除細胞系，并研究敲除一個組織中內(nèi)的基因如何影響其他組織中的相同基因。

Easi-CRISPR用于使用長ssDNA供體創(chuàng)建敲入和條件敲除小鼠模型

基于CRISPR/Cas9的基因組編輯可以通過破壞基因序列輕松產(chǎn)生敲除小鼠的原代細胞，但是創(chuàng)建需要插入外源DNA（敲入）或替換基因組片段的模型效率非常低。這項研究中使用的大多數(shù)小鼠模型都涉及敲入（報道基因或重組酶）或基因替換（例如，含有側(cè)翼為LoxP位點的外顯子條件敲除等位基因）。已經(jīng)報告了創(chuàng)建此模型的一些方法。這些方法使用雙鏈DNA作為供體，但效率通常為1-10％，因此不適合常規(guī)使用。研究人員最近證明，長單鏈DNA（ssDNA）可以是非常有效敲除供體，無論是插入還是基因替換。研究人員稱此方法為ssDNA insert-CRISPR（Easi-CRISPR）的有效補充，因為它是一種有效的技術(shù)（效率通常為30-60％，在某些情況下可達100％）。該協(xié)議將花費大約2個月的時間來生產(chǎn)創(chuàng)始人老鼠，從而研究起敲除小鼠的原代細胞和編輯。

CRISPR-Cas9核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生了基因敲除細胞系的條件，揭示了冠心病在秀麗隱桿線蟲神經(jīng)發(fā)育中的作用

基因敲除動物的細胞系是研究細胞和發(fā)育生物學基本機制的寶貴工具。研究人員通過操縱秀麗隱桿線蟲的體細胞譜系中RNA指導的DNA核酸內(nèi)切酶CRISPR-Cas9的表達，開發(fā)了一種條件敲除策略。研究人員表明，這種CRISPR-Cas9體細胞技術(shù)提供了一種快速有效的方法來在不同發(fā)育階段的各種細胞類型中產(chǎn)生條件基因敲除。此外，研究人員證明，這種方法優(yōu)于我們最近開發(fā)的體細胞TALEN技術(shù)，并且可以一步生成多個基因細胞的條件敲除。通過將這些技術(shù)與活細胞成像相結(jié)合，研究人員表明，與人類神經(jīng)行為功能有異常相關(guān)的必需胚胎基因Coronin可以調(diào)節(jié)神經(jīng)母細胞遷移和神經(jīng)形成過程中中央線蟲的肌動蛋白組織。和細胞形態(tài)。研究人員提出，體細胞CRISPR-Cas9平臺中特別適合基因編輯條件的生物醫(yī)學研究。

使用誘導性端粒/掩蔽蛋白CRISPR/Cas9敲除細胞對人端粒功能障礙進行的系統(tǒng)分析

CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)可以使用人體細胞對人類基因進行有效的功能喪失分析。但是，必需基因的研究需要條件敲除（KO）細胞。研究人員描述了可以誘導CRISPR KO人類細胞系產(chǎn)生的端粒/shelterin復合物。 TRF1，TRF2，RAP1，TIN2，TPP1和POT1的亞基與端粒相互作用或可以與其他端粒分離。幾個亞基的純合滅活在小鼠中是致命的。關(guān)于人類端粒調(diào)節(jié)子功能喪失的大多數(shù)研究都依賴于RNA干擾介導的基因敲除，這有其自身的局限性。我們的可誘導CRISPR方法使我們能夠更方便地獲得大量細胞系，其中必需的端粒調(diào)節(jié)劑已被滅活，用于生化和分子研究。我們的系統(tǒng)分析揭示了人類和小鼠端粒蛋白在DNA損傷反應，端粒長度和代謝控制方面的功能差異，從而為維持端粒提供了新的見解。

Ubigene的目標是簡化基因組編輯。Ubigene開發(fā)了CRISPR-U?（基于CRISPR/Cas9技術(shù)），在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR/Cas9更有效，而CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率并輕松實現(xiàn)敲除（體內(nèi)）（體外）點突變（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U?，Ubigene已成功編輯了100多個細胞系上的基因。

Reference

Miura H, Quadros R M, Gurumurthy C B, et al. Easi -CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors[J]. Nature Protocols, 2018, 13(1): 195-215.

Shen Z, Zhang X, Chai Y, et al. Conditional knockouts generated by engineered CRISPR-Cas9 endonuclease reveal the roles of coronin in C. elegans neural development.[J]. Developmental Cell, 2014, 30(5): 625-636.

Kim H, Li F, He Q, et al. Systematic analysis of human telomeric dysfunction using inducible telosome/shelterin CRISPR/Cas9? knockout cells[J]. Cell discovery, 2017, 3(1).

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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