植物轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝過(guò)程及生物、非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本期我們帶來(lái)了一篇玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmCCT的文章，通過(guò)DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)ZmCCT可以調(diào)節(jié)玉米光周期依賴性開花和脅迫響應(yīng)。

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題目：ZmCCT?regulates photoperiod-dependent flowering and response to stresses?in maize

期刊：BMC Plant Biology

材料：WT植株和OE-ZmCCT植株

方法：RNA-seq、DAP-seq、EMSA、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-PCR（愛基百客均可提供）

研究背景

適宜的花期對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。玉米（Zea maysL.）是一種主要的谷類作物，原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，具有光周期敏感性。這是溫帶地區(qū)熱帶/亞熱帶種質(zhì)資源利用的主要障礙。然而，玉米光周期敏感性調(diào)控機(jī)制的研究尚處于早期階段。盡管之前有報(bào)道稱ZmCCT參與光周期響應(yīng)，并在長(zhǎng)日照條件下延遲玉米開花時(shí)間，但其潛在機(jī)制仍不清楚。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.?LD條件下，開花時(shí)間和抗旱性的表型變化

在LD（長(zhǎng)日照）條件下，與WT植株相比，T2代的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出延遲開花5-9天。在 SD 條件下，OE- ZmCCT的開花時(shí)間與 WT沒有觀察到顯著差異（圖1a，b）。在 LD 條件下，OE- ZmCCT的總?cè)~數(shù) (TLN)高于 WT（圖1c）。這些結(jié)果表明在LD條件下，過(guò)表達(dá)ZmCCT會(huì)延遲玉米開花。此外，在LD條件下，OE- ZmCCT和WT植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)出顯著差異（圖1d）。在干旱脅迫處理后，OE- ZmCCT植株的 RWC（相對(duì)含水量）顯著高于 WT植株（圖1e）。這些結(jié)果表明ZmCCT在 LD 條件下具有調(diào)節(jié)玉米開花時(shí)間和脅迫響應(yīng)的雙重功能。

2. RNA-Seq 鑒定受ZmCCT影響的基因

為了了解ZmCCT響應(yīng)光周期介導(dǎo)的開花過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在SD（短日照）?和 LD 條件下，使用從野生型（WT）和ZmCCT過(guò)表達(dá)植株（OE- ZmCCT）的V6 生長(zhǎng)階段的葉子中提取的總RNA進(jìn)行RNA-Seq。在 SD 和 LD 條件下分別鑒定出91和 746 個(gè)差異基因（圖 2a）。在 LD 條件下有599個(gè)差異基因被注釋到功能（圖2a，b），這些基因的GO富集分析表明，它們主要參與細(xì)胞過(guò)程、對(duì)刺激的響應(yīng)、代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、發(fā)育過(guò)程以及花發(fā)育。最重要的子類別是“對(duì)非生物刺激的響應(yīng)”。其他有趣的重要子類別是“對(duì)刺激的響應(yīng)”和“花朵發(fā)育”。熱圖顯示 LD 條件下 WT 和 OE- ZmCCT之間的一些差異表達(dá)基因（圖2c）。

3.ZmCCT同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制活性

為了研究ZmCCT是否可以作為基因表達(dá)的啟動(dòng)子或抑制子，在酵母中進(jìn)行ZmCCT反式激活分析，它表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄激活活性（圖 3a）。然而，ZmCCT編碼一種 CCT 結(jié)構(gòu)域蛋白（圖3b ），據(jù)報(bào)道該蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制活性 [ 21、29 ]。為了證實(shí)這一點(diǎn)，利用Gal4-LexA/UAS系統(tǒng)分析該蛋白質(zhì)的正或負(fù)轉(zhuǎn)錄潛能。ZmCCT顯著降低了報(bào)告基因的表達(dá)（圖3c），表明ZmCCT具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。總之，ZmCCT可能同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制活性。

4.DAP-Seq實(shí)驗(yàn)鑒定ZmCCT靶基因

通過(guò)DAP-Seq 實(shí)驗(yàn)鑒定ZmCCT直接調(diào)控的潛在靶基因。DAP-Seq分析結(jié)果中共有 15,862 個(gè)peak峰，與兩個(gè)motif顯著相關(guān)，即 AAATGGTC 和 CAAAAATC（圖 4a）（p-值 < 0.05)。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 ZmCCT 蛋白與 AAATGGTC 和 CAAAAATC 基序的特異性結(jié)合（圖4d）。所有檢測(cè)到的峰中，大約 21%位于基因區(qū)域，包括啟動(dòng)子、5'UTR、3'UTR、內(nèi)含子和外顯子（圖4b）。peak峰關(guān)聯(lián)的基因GO富集分析表明，這些基因在對(duì)刺激的響應(yīng)和花發(fā)育子類中有顯著富集（圖4c）。在這些基因中，ZmCCT可能與1602個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，這些基因主要參與細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞器組織、花發(fā)育、轉(zhuǎn)錄因子活性和對(duì)刺激的響應(yīng)。????

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因作為ZmCCT直接調(diào)控的特定靶標(biāo)的表達(dá)水平，作者分析了在 LD 條件下WT 和 OE-ZmCCT的差異基因與上游區(qū)域ZmCCT直接調(diào)控的靶基因之間的重疊基因。確定了可能與開花時(shí)間調(diào)節(jié)、脅迫響應(yīng)和花發(fā)育有關(guān)的21個(gè)差異基因。在這21個(gè)基因中，11個(gè)基因在OE- ZmCCT植物中上調(diào)，而其余10個(gè)基因下調(diào)。

5.ZmCCT直接調(diào)控與光周期依賴性開花時(shí)間相關(guān)的基因

DAP-Seq和RNA-Seq聯(lián)合分析確定了10個(gè)與調(diào)控開花相關(guān)的ZmCCT潛在靶基因。為了研究ZmCCT是否可以調(diào)控這些潛在靶基因的表達(dá)，在煙草葉片中進(jìn)行了雙熒光素酶瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定（Dual-LUC）。35S:: ZmCCT作為效應(yīng)子，LUC（螢火蟲熒光素酶編碼基因）由潛在靶基因的不同啟動(dòng)子區(qū)域（- 3000 至 - 100 bp）驅(qū)動(dòng)作為報(bào)告基因（圖 5a）。結(jié)果表明，ZmCCT蛋白促進(jìn)10個(gè)靶基因中3個(gè)的表達(dá)，同時(shí)抑制其余7個(gè)基因的表達(dá)（圖5b）。特別地，ZmCCT與ZmPRR5（- 1567 bp）、ZmRVE6（- 420 bp）和ZmCOL9 （- 1315 bp）的啟動(dòng)子結(jié)合以促進(jìn)ZmRVE6的表達(dá)，并抑制ZmPRR5和ZmCOL9的表達(dá)（圖5b)。

6.ZmCCT直接調(diào)節(jié)了一套響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)基因

RNA-Seq 結(jié)果顯示對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)相關(guān)的9個(gè)基因有差異表達(dá)，其中6個(gè)基因在OE-ZmCCT中上調(diào)，3個(gè)基因下調(diào)。Dual-LUC測(cè)定結(jié)果證實(shí)了 RNA-Seq 的結(jié)果（圖5b、6a）。這9個(gè)基因中的4個(gè)，即ZmVOZ1 、ZmARR16、ZmHY5和ZmMPK3，已知與干旱脅迫反應(yīng)有關(guān)。結(jié)果進(jìn)一步表明，ZmCCT與ZmVOZ1和ZmARR16啟動(dòng)子結(jié)合抑制其表達(dá)，與ZmHY5和ZmMPK3啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)（圖5b，6a)。

為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，檢測(cè)了在LD條件下充分灌溉和干旱脅迫處理的WT 和 OE- ZmCCT植株中這9個(gè)基因的mRNA水平。RT-qPCR結(jié)果表明，干旱脅迫下，ZmHY5和ZmMPK3在 OE –ZmCCT和WT 植株中的表達(dá)量均上調(diào)，且在OE-ZmCCT植株的表達(dá)量明顯高于WT植株（圖6b）。與此同時(shí)，在干旱脅迫誘導(dǎo)后， ZmVOZ1和ZmARR16在OE- ZmCCT和WT植株中均被下調(diào)，且在OE-ZmCCT植株中表達(dá)量明顯低于WT植株（圖6b）。其余5個(gè)基因的表達(dá)水平在充分灌溉和干旱脅迫處理之間沒有顯著差異（圖6b）。這些結(jié)果表明ZmCCT主要通過(guò)直接調(diào)控這4種干旱脅迫相關(guān)基因（ ZmHY5、ZmMPK3、ZmVOZ1和ZmARR16）的表達(dá)來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。

研究結(jié)論

ZmCCT在LD條件下具有調(diào)節(jié)玉米開花時(shí)間和脅迫響應(yīng)的雙重功能。在LD條件下，ZmCCT負(fù)向調(diào)控開花時(shí)間，并增強(qiáng)玉米的耐旱性。ZmCCT通過(guò)抑制與開花時(shí)間相關(guān)的基因來(lái)延遲開花，并通過(guò)促進(jìn)脅迫響應(yīng)基因來(lái)增強(qiáng)抗逆性。基于研究結(jié)果，作者提出了ZmCCT在玉米開花時(shí)間和脅迫響應(yīng)中的調(diào)控模型。該研究結(jié)果有助于全面了解ZmCCT在調(diào)節(jié)玉米開花時(shí)間和脅迫反應(yīng)方面的調(diào)控機(jī)制。