艾美捷FAM-FLICA Caspase-1 (YVAD) Assay Kit FAM-FLICA Caspase-1?活性分析試劑盒檢測方案：

1、凋亡誘導：

在開始實驗之前，確定可重復的方法用于通過觸發(fā)胱天蛋白酶活性獲得陽性對照。此過程隨每個細胞系而顯著變化。例如，細胞凋亡可能是用2-4μg/mL喜樹堿或1-2μM星形孢霉素誘導>4小時。 ?

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2、焦下垂誘導：

最佳的焦下垂/胱天蛋白酶-1誘導方案將有顯著差異在細胞系之間。在開始實驗之前，確定獲得caspase-1陽性對照的可重復方法。例如在細胞培養(yǎng)基中使用5-10ng/mL肉豆蔻酸佛波酯（PMA）12-24小時（直到細胞粘附），然后暴露于100 ng/mL脂多糖（LPS）和5mM三磷酸腺苷（ATP）混合24小時?；蛘?，在37°C下，在1-20μM的細胞培養(yǎng)基中使用尼格瑞金，可在細胞中誘導2-24小時。每個研究者應調(diào)整Nigericin的濃度和治療期，以適應特定的細胞系和研究條件。

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3、FLICA的制備：

FLICA以凍干粉形式提供小瓶內(nèi)的虹彩光澤。避免光線照射，并在以下情況下使用手套處理。因為必須立即使用30X FLICA溶液，所以在染色前準備好。1.用50μL DMSO重新配制每小瓶FLICA，形成150X股票儲備溶液應為無色至黃色或橙色。一旦復原，可將其儲存在≤-20°C，保護6個月在此期間解凍不超過兩次。2.在加入樣品和對照品之前，立即稀釋通過向每個小瓶中添加200μL PBS，形成30X FLICA 1:5解決方案在稀釋到水溶液中30分鐘內(nèi)使用30X FLICA

緩沖區(qū)。

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4、1X凋亡洗滌緩沖液的制備：

ICT的細胞凋亡洗滌緩沖液（目錄#634和#635，AWB）是一種等滲溶液，用于在暴露于FLICA后洗滌細胞。它含有哺乳動物蛋白質(zhì)，可穩(wěn)定用FLICA染色的細胞和疊丨氮化鈉細菌生長（1X凋亡洗滌緩沖液含有0.01%w/v鈉疊丨氮化物）。可以使用含有FBS和其他添加劑的細胞培養(yǎng)基以洗滌細胞而不是細胞凋亡洗滌緩沖液。

10X細胞凋亡洗滌緩沖液在冷藏期間可能形成沉淀。如果發(fā)生這種情況，輕輕加熱，直到所有晶體溶解。不要煮沸。

在diH2O中以1:10稀釋10X凋亡洗滌緩沖液。例如，添加15mL 10X細胞凋亡洗滌緩沖液至135mL diH2O，總共150mL。

?1X凋亡洗滌緩沖液可儲存在2-8°C，或冷凍并在6個月內(nèi)使用。

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圖：Jurkat細胞用陰性對照DMSO（左）或凋亡誘導劑星孢霉素（右）處理4小時，然后用ICT染色綠色聚半胱天冬酶抑制劑探針FAM-VAD-FMK（試劑盒#92）1小時。細胞洗滌兩次并在流式細胞儀上讀取。陰性對照僅在3.3%的細胞群中表現(xiàn)出半胱天冬酶活性（P3，左側(cè)直方圖），而星孢霉素治療誘導的caspase活性為94.8%（P3，右直方圖）。這是28:1的比率。數(shù)據(jù)特蕾西·墨菲女士提供，ICT，10G5。

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艾美捷Immunochemistry?Caspase-1活性分析試劑盒組分：

The test size kit contains:

??1 bottle of FAM-FLICA cystatin reagent

??1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (15 mL), # 635

??1 bottle of fixative (6 mL), # 636

??1 vial of iodopropyl, 250 μ g/mL (1 mL), # 638

??1 vial Hoechst 33342200 μ g/mL (1 mL), # 639

The standard size kit contains:

??4 bottles of FAM-FLICA cystatin reagent

??1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (60 mL), # 634

??1 bottle of fixative (6 mL), # 636

??1 vial of iodopropyl, 250 μ g/mL (1 mL), # 638

??1 vial Hoechst 33342200 μ g/mL (1 mL), # 639.

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將未開封的套件和每個未開封的組件儲存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的溫度下儲存6個月，避光，解凍時間不超過在這段時間內(nèi)兩次。

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艾美捷Immunochemistry?Caspase-1活性分析試劑盒實驗準備:

用FLICA染色細胞可以在幾個小時內(nèi)完成。然而FLICA用于活細胞，需要定期維護和提前幾天栽培。此外，一旦正確的數(shù)字已經(jīng)培養(yǎng)了個細胞，必須為實驗分配時間治療或半胱天冬酶激活過程。創(chuàng)建細胞群，例如：

a、 暴露于實驗處理的細胞

b、 接受安慰劑的陰性對照細胞群治療

當FLICA檢測到催化活性形式的胱天蛋白酶時酶，計劃實驗，以使FLICA在細胞中預期胱天蛋白酶被激活時被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300μL細胞10μL3-5 x 105細胞/mL，但數(shù)量可能因?qū)嶒灦悧l件和用于分析的儀器。每位研究者應調(diào)整FLICA的量以適應特定細胞系研究條件。

將細胞培養(yǎng)至適合特定實驗條件的最佳密度或凋亡誘導方案。細胞密度不應超過106細胞/

超過此濃度培養(yǎng)的細胞可開始自然生長進入凋亡。可能需要進行初步實驗來確定何時以及使用多少FLICA作為產(chǎn)生的正信號是培養(yǎng)過程中caspase活性的直接測量時期.

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